Реакция иммунофлюоресценции (риф)

Реакция иммунофлюоресценции — РИФ (метод Кунса). Различают три разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Реакция Кунса является методом экспресс-диагностики для выявления антигенов вирусов. Прямой метод РИФ основан на том, что антигены вирусов, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген (вируссодержащий материал) — антитело (иммунные сыворотки) с помощью антиглобулиновой (животные антитела против человеческих иммуноглобулинов) сыворотки, меченной флюорохромом.

РАДИОИММУНЫЙ АНАЛИЗ (РИА)

Радиоиммунный анализ(РИА) —высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген — антитело с применением антигенов или антител, меченных радиоизотопом (125J, 14С, 3Н,51Сrи др.). После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и определяют его радиоактивность в соответствующем счетчике (бета- или гамма-излучение): интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. Ингредиенты:исследуемый антиген (вирус),иммунная сыворотка (антитела, меченные радиоизотопом).

Методы генетической идентификации вирусов

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет обнаружить вирус в исследуемом материале (воде, продуктах, материале от больного) по наличию в нем ДНК или РНК вируса без выделения последнего в чистой культуре. Для проведения этой реакции из исследуемого материала выделяют ДНК, в которой определяют наличие специфичного для данного вируса гена. ПЦР основан на амплификации, т.е. увеличении количества копий специфического (маркерного) гена возбудителя. Для этого двунитевую ДНК, выделенную из исследуемого материала, денатурируют (“расплетают” при нагревании) и достраивают, при охлаждении, к расплетенным нитям ДНК новые комплементарные нити, в результате чего из одного гена образуются два. Этот процесс копирования генов многократно повторяется при заданных температурных режимах. Достраивание новых комплементарных нитей ДНК происходит при добавлении к искомым генам праймеров (затравки из коротких однонитевых цепочек, комплементарно достраивающих нити ДНК исходного гена в направлении от 5'-конца к 3'- концу), ДНК-полимеразы и нуклеотидов. А в случае с РНК-содержащими вирусами на первом этапе осуществляется синтез ДНК на матрице геномной РНК (обратная транскрипция при участии фермента ревертазы), далее процесс амплификации (накопления) происходит по вышеописанной схеме. Ингредиенты: исследуемый материал (ДНК или РНК вируса/бактерии), праймеры (специфические олигонуклеотидные цепочки, комплементарно достраивающие нити ДНК исходного гена в направлении от 5'-конца к 3'- концу), ДНК-полимеразы и нуклеотидов

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ (МГ)

Метод молекулярной гибридизации ДНК-ДНК используется для установления геномного родства в пределах рода и семейств микроорганизмов; РНК-ДНК на уровне порядка. Степень сходства или гомологичность последовательностей ДНК выражается процентом (%) гомологии и является мерой геномного родства микроорганизмов. Применяется при идентификации микробов для определения их точного таксономического положения. Метод основан на способности двухцепочечной ДНК при повышенной температуре (90°C) в щелочной среде денатурировать, т.е. расплетаться на две нити, а при понижении температуры на 10°C вновь восстанавливать исходную двухцепочечную структуру. Метод требует наличия молекулярного зонда. Зондом называется одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты, меченая радиоактивными нуклеидами, с которой сравнивают исследуемую ДНК. Для проведения молекулярной гибридизации исследуемую ДНК расплетают указанным выше способом, одну нить фиксируют в специальным фильтре, который затем помещают в раствор, содержащий радиоактивный зонд. Создаются условия, благоприятные для образования двойных спиралей. В случае наличия комплементарности между зондом и исследуемой ДНК, они образуют между собой двойную спираль. Ингредиенты:ДНК типичного штамма, меченая радиоизотопом (3H тритием или 32P фосфором), исследуемая ДНК, твердая фаза (гранулированный агар, мембранные нитроцеллюлозные или нейлоновые фильтры), жидкая среда, нуклеаза S1, р-р гидроксиаппатита

III. План практической работы

Учесть и зарисовать раннюю реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) в диагностике гриппа (см. механизм реакции в базовом тексте).

Метод диагностики:вирусологический

Компоненты: типоспецифические противогриппозные сыворотки (содержащие антитела к вирусам гриппа А, А1, А2 и В), исследуемый материал (вирус гриппа, культивированный в тканевых культурах), изотонический раствор хлорида натрия, 1% суспензия куриных эритроцитов.

Постановка:Разведение соответствующих типоспецифических противогриппозных сывороток в ряде лунок, используя 0,9% раствор NaCl (см. разведения на планшетке). В каждую лунку вносят по 0,2 мл исследуемого вируса. Выдерживают 60 мин. при комнатной температуре. Затем в каждую лунку вносят по 0,4 мл. 1% суспензии куриных эритроцитов. Инкубация в течение 2-х часов при температуре 37°C.

Учет: Положительная реакция «+» — осадок с ровными краями в виде красной пуговки. Отрицательная реакция «-» — осадок с неровными краями в виде красного зонтика. Титр РТГА определяют по максимальному разведению, при котором наблюдается торможение гемагглютинация (красная пуговка).

Заключение: Вирусологический материал содержит вирус гриппа А2 в титре 1/320.