Механизмы антибиотикорезистентности микроорганизмов

Антибиотикорезистентность —это устойчи­вость микробов к антимикробным химиопрепаратам. Бактерии следует считать резистент­ными, если они не обезвреживаются такими концентрациями препарата, которые реально создаются в макроорганизме. Резистентность может быть природной и приобретенной.

Природная устойчивость. Некоторые виды микробов природно ус­тойчивы к определенным семействам антиби­отиков или в результате отсутствия соответс­твующей мишени (например, микоплазмы не имеют клеточной стенки, поэтому не чувстви­тельны ко всем препаратам, действующим на этом уровне), или в результате бактериальной непроницаемости для данного препарата (на­пример, грамотрицательные микробы менее проницаемы для крупномолекулярных соеди­нений, чем грамположительные бактерии, так как их наружная мембрана имеет «маленькие» поры).

Приобретенная устойчивость. Бактерии стали чрезвычай­но быстро приспосабливаться, постепенно формируя устойчивость ко всем новым пре­паратам. Под приобретенной устойчивостьюпонимают свойство отдельных штаммов бактерий сохранять жизнеспособность при тех концентрациях антибиотиков, которые подавляют основную часть микробной популяции. Возможны ситуации, когда большая часть микробной популяции проявляет приобретенную устойчивость. Появление у бактерий приобретенной резистентности не обязательно сопровождается снижением клинической эффективности антибиотика.

Приобретение резистентности — это биологическая закономерность, связанная с адаптацией микроорганизмов к условиям внешней среды. В разной степени резистентность характерна для всех бактерий и всех анти­биотиков. К химиопрепаратам адаптируются не только бактерии, но и остальные микро­бы — от эукариотических форм (простейшие, грибы) до вирусов. Проблема формирования и распространения лекарственной резистен­тности микробов особенно значима для внутрибольничных инфекций, вызываемых так называемыми «госпитальными штаммами», у которых, как правило, наблюдается множес­твенная устойчивость к антибиотикам (так называемая полирезистентность). Бактерии, способные к полирезистентности, являются природными хранилища­ми генов лекарственной устойчивости. Как известно, мутации, в том числе по признаку лекарствен­ной устойчивости, спонтанны и возникают всегда.

Плазмидная устойчивость приобретается микробными клетка­ми в результате процессов генетического обмена. Сравнитель­но высокая частота передачи R-плазмид обеспечивает широкое и достаточно быстрое распространение устойчивых бактерий в популяции, а селективное давление антибиотиков — отбор и закрепление их в биоценозах. Плазмидная устойчивость может быть множественной, т. е. к нескольким лекарственным препаратам, и при этом достигать достаточно высокого уровня.

Формирование резистентности во всех случаях обусловлено генетически: приобретением новой генетической информации или изменением уровня экспрессии собственных генов.

Биохимическую основу резистентности обеспечивают разные механизмы:

• энзиматическая инактивация антибиотиков — осуществляется с помощью синтезируемых бактериями ферментов, разрушаю­щих активную часть антибиотиков. Одним из таких широко известных ферментов является бета-лактамаза, обеспечиваю­щая устойчивость микроорганизмов к бета-лактамным анти­биотикам за счет прямого расщепления бета-лактамного кольца этих препаратов. Другие ферменты способны не расщеплять, а модифицировать активную часть молекулы антибиотиков, как это имеет место при энзиматической инактивации аминогликозидов и левомицетина;

• изменение проницаемости клеточной стенки для антибиотика или подавление его транспорта в бактериальные клетки. Этот механизм лежит в основе устойчивости к тетрациклину;

• изменение структуры компонентов микробной клетки, например, изменение структуры бактериальных рибосом, сопровождается повышением устойчивости к аминогликозидам и макролидам, а изменение структуры РНК-синтетаз — к рифампицину;

• образование бактериями “обходного” пути метаболизма;

• формирование механизмов активного выведения антибиотика из клетки.

У бактерий одного и того же вида могут реализовываться не­сколько механизмов резистентности. В то же время развитие того или другого типа резистентности определяется не только свойствами бактерий, но и химической структурой антибиотика.

Для борьбы с лекарственной устойчивостью, т. е. для преодоле­ния резистентности микроорганизмов к химиопрепаратам, су­ществует несколько путей:

• соблюдение принципов рациональной химио­терапии;

• создание новых химиотерапевтических средств, отличающихся механизмом антимикробного действия (например, созданная в последнее время группа химиопрепаратов — фторхинолоны) и мишенями;

• постоянная ротация (замена) используемых в данном лечебном учреждении или на определенной территории химиопрепара­тов (антибиотиков);

• комбинированное применение бета-лактамных антибиотиков со­вместно с ингибиторами бета-лактамаз (клавулановая кислота, сульбактам, тазобактам).Например, амоксиклав (амоксициллин+клавунат натрия и др.). Известен также ряд средств, обладающих наряду с антибактериальным действием, способностью элиминировать плазмиды резистентности к другим антибиотикам — например, фторхинолоны, хлоргексидин.

Из-за формирования антибиотикоустойчивых популяций микроорганизмов с целью эффективного лечения необходимо предварительно определять чувствительность данного антибиотика к выделенной культуре возбудителя.

6. Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам

Критериями активности того или иного препарата выступают минимальная ингибирующая концентрация (МИК) — наименьшая концентрация препарата, тормозящая рост тест-культуры, и минимальная бактерицидная концентрация (МБК) — наименьшая концентрация препарата, вызывающая бактерицидный эффект, т.е. гибель 99,9 % микроорганизмов.

Основными методами определения антибиотикочувствительности бактерий in vitro является метод серийных разведений, диффузии в агар (бумажных дисков), ускоренные методы определения чувствительности к антибактериальным препаратам, определение способности к продукции бета-лактамазы, Е-тест.

Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам методом серийных разведений (количественный метод).Данный метод определения антибиотикочувствительности является количественным и позволяет определить МИК и МБК. Серийный метод титрования может быть выполнен в разных объемах среды (от 1 до 10 мл). Эксперименты выполняются в условиях асептики при использова­нии стерильных пипеток для каждого ингредиента реак­ции. Титрование можно проводить в плотных и жидких средах.

При титровании в жидких средах в ряд пробирок на­ливают питательную среду в строго определенном объе­ме. Количество пробирок определяется количеством раз­ведений препарата, которое необходимо взять в опыт. В 1-ю пробирку вносят определенное количество раство­ра антибиотика, перемешивают, затем определенный объ­ем смеси из 1-й пробирки переносят во 2-ю, перемешива­ют и переносят то же количество смеси из 2-й в 3-ю и т. д. Из последней пробирки, содержащей антибиотик, такой же объем смеси выливают, чтобы во всех пробирках объем жидкости был одинаков. Кратность разведения антибиотика обычно выбира­ют равной двум. Пробирка, не содержа­щая антибиотика, является контрольной. После этого во все пробирки, содержащие серийно разведенный анти­биотик, и в контрольную пробирку вносят одинаковое ко­личество взвеси тест-культуры. Штатив с про­бирками встряхивают и ставят в термостат при 37°С на 18—20 ч.

Взвесь клеток исследуемой культуры готовят на изотоничес­ком растворе хлорида натрия при обязательном сравне­нии со стандартами мутности.

Метод серийных разведений в плотных средах отли­чается тем преимуществом, что микробы-загрязнители при этом легко выявляются и не изменяют общих результатов титрования, тогда как на жидких средах весь опыт может оказаться безрезультатным из-­за попадания в пробирки хотя бы единичных клеток посторонних устойчивых микроорганизмов. Этот метод используют и при работе с микроорганизмами, ко­торые не растут на обычных жидких средах, например, микобактерии туберкулеза. Гото­вят ряд серийных разведений антибиотика, а затем вно­сят по 1 мл каждого разведения в пробирку, содержа­щую 4 мл расплавленной и охлажденной до 45—50°С агаризованной среды. Затем пробирки скашивают до за­стывания агара, а на поверхность плотной среды петлей засевают взвесь тест-культуры.

Для выявления бактерицидного действия препарата делают высев на МПА из всех пробирок, где визуально не отмечен рост микроорганизма (рис. 17).

Бактерия

MИК=1 мг/мл

24 часа

37°С

8 4 2 1 0,5 0,25 8 4 2 1 0,5 0,25

		МБК=4 мг/мл

Рис. 17. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам методом серийных разведений

Определение чувствительности микроорганизмов методом дисков(качественный метод)—метод диффузии в агар с применением стандартных дисков, пропитанных различными антибиотиками в определенных концентрациях (рис. 18). Оценка результатов связана с существованием зависимости между размером зоны подавления роста исследуемых культур вокруг дисков и значениями МИК соответствующих антибиотиков (чувствительностью микроорганизмов). Имеются специальные таблицы для оценки результатов, в соответствии с которыми культуры определяют как чувствительные, промежуточно чувствительные и устойчивые (резистентные) к тестируемому антибиотику. Диско-диффузионный метод используется для оценки эффективности антибиотиков в клини­ческих условиях. Питательную среду (Мюллера-Хинтона-2, АГВ) разливают в чаш­ки, помещенные на строго горизонтальной поверхности, заполнив их на одинаковую высоту 4 мм (25 мл среды для чашек с внутренним диаметром 9 см). Клинический материал или культуру микроорганизмов, выделенную от больного, засевают на поверхность питательного ага­ра сплошным газоном.

После посева крышку чашки при­открывают не более чем на 15 мин и дают поверхности среды подсохнуть. Затем стерильным пинцетом следует положить на поверхность агара бумажные диски, про­питанные раствором определенного антибиотика, и слег­ка придавить. Расстояние между дисками и краем чаш­ки должно быть не менее 15 мм.

Рис. 18. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам диско-диффузионным методом.

Чашки инкубируют около 18 ч при 37°С в перевернутом положении. При на­личии чувствительной к антибиотику микрофлоры вокруг со­ответствующих дисков отмечается зона угнетения роста микроорганизмов. Диаметр зоны измеряют с точностью до 1 мм, определяя чувствительность (чувствительность, промежуточная чувствительность и резистентность).

Элипсометрический метод (Е-тест) занимает промежуточное положение между методом бумажных дисков и методом серийных разведений, являясь качественно-количественным методом (рис. 19). В нем используется узкая полоска полимера, пропитанная разными концентрациями антибиотика (от минимальных до макси­мальных), которая наносится на поверхность плотной питательной среды, предварительно засеянной испытуемой культурой. Задержка роста культуры вокруг полоски наблюдается в той зоне, где концентрация антибиотика выше МИК. На поверхности полоски нанесены величины концентрации антибиотика в каждом участке. Если культура обладает чувствительностью к антибиотику, то зона задержки роста имеет каплевидную (элипсовидную) форму. За величину минимальной ингибирующей концентрации (МИК) антибиотика принимают отрезок полоски, к которому вплотную подходит рост микроба.

Рис. 19. Определение чувствительности микроорганизмов с помощью Е-тестов.

Интерпретация результатов определения чувствительности микробных культур

На основании получаемых количественных данных (диаметра зоны подавления роста антибиотика или значения МИК) микроорганизмы подразделяют на чувствительные, промежуточно чувствительные и резистентные.

Чувствительные микроорганизмы (S — sensible).Клинически к чувствительным относят бактерии (с учетом параметров, полученных in vitro), если при лечении стандартными дозами антибиотика инфекций, вызываемых этими микроорганизмами, наблюдают хороший терапевтический эффект.

Резистентные микроорганизмы (R — resistant).К резистентным (устойчивым) относят бактерии, когда при лечении инфекции, вызванной этими микроорганизмами, нет эффекта от терапии даже при использовании максимальных доз антибиотика. Такие микроорганизмы имеют механизмы резистентности.

Микроорганизмы с промежуточной чувствительностью (I — intermediate).Клинически промежуточную чувствительность у бактерий подразумевают в случае, если инфекция, вызванная такими штаммами, может иметь различный терапевтический исход. Однако лечение может быть успешным, если антибиотик используется в дозировке, превышающей стандартную, или инфекция локализуется в месте, где антибактериальный препарат накапливается в высоких концентрациях.

Значение минимальной бактерицидной концентрации используют при терапии антибиотиками, обладающими бактериостатическим действием, или при отсутствии эффекта от антибактериальной терапии у особой категории больных. Частными случаями для определения МБК могут быть, например, бактериальный эндокардит, остеомиелит или генерализованные ин­фекции у пациентов с иммунодефицитными состояниями.

III. План практической работы

1. Определить спектр действия антибиотиков

Для определения спектра действия антибактериальных препаратов применяется метод «дорожек Флеминга». Для проведения используется чашка Петри с плотным питательным агаром. В центре вырезают бороздку, в которую помещают раствор антибактериального препарата определенной концентрации. По краям от бороздки производят посев тестовых культур методом перпендикулярных штрихов. В качестве тестовых культур используют S.aureus (грамположительные кокки), E.coli (грамотрицательные палочки), B.subtilis (спорообразующие грамположительные палочки). Антибактериальный препарат диффундирует в толщу агара, и происходит подавление роста тестовой культуры, при условии ее чувствительности. Спектр действия определяется количеством тест-культур, чувствительных к действия данного антибактериального препарата: 1, 2 тест-культуры — узкий спектр, все тест-культуры — широкий спектр действия.

2. Определить чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом серийных разведений (количественный метод). См подробнее в тексте.

Делается последовательный ряд двукратных разведений антибиотика в МПБ, затем в каждую пробирку вносится равное количество исследуемой культуры. Ставят в термостат на 18-20 часов. Последняя прозрачная пробирка показывает бактериостатическую концентрацию (микроорганизмы не размножаются, но и не погибают). Для определения бактерицидной концентрации (гибель микробов) делают пересев из прозрачных пробирок на МПА, не содержащий антибиотика.

3. Определить чувствительность микроорганизмов к антибиотикам методом бумажных дисков (качественный метод). См подробнее в тексте.

Исследуемую культуры засевают газоном на питательную среду. После посева крышку чашки при­открывают и дают поверхности среды подсохнуть. Затем стерильным пинцетом поместить бумажные диски, про­питанные раствором определенного антибиотика на поверхность агара и слег­ка придавить. Чашки инкубируют около 18 ч при 37°С в перевернутом положении. При на­личии чувствительной к антибиотику флоры вокруг со­ответствующих дисков отмечается зона угнетения роста микроорганизмов. Учёт чувствительности измеряют по диаметру зоны задержки роста в мм.

4. Определить чувствительность микрофлоры зева к антибиотикам с помощью Е-теста.

Полоски из фильтровальной бумаги, пропитанной различными концентрациями антибиотика, помещают на поверхность агара. При чувствительности бактерий к действию препарата, вокруг участков полости образуется эллипсовидная зона. МИК соответствует участок полоски, где ее пересекает граница зоны задержки роста (рис. 17).

5. Разобрать основные группы химиопрепаратов и антибиотиков

6. Заполнить таблицы « Классификация антимикробных препаратов по механизму действия»

7. Решить ситуационные задачи

УИРС.Определить чувствительность микрофлоры зева к антимикробным препаратам.