Нормативы питьевой воды (ГОСТ 2874-82) — МИКРОБНОЕ ЧИСЛО НЕ БОЛЕЕ 100 в 1 МЛ, ЧИСЛО ОКБ В 1 Л ВОДЫ (коли-индекс) НЕ БОЛЕЕ 3 и (коли-титр) НЕ МЕНЕЕ 333 МЛ.

В ряде случаев проводят определение в воде спор сульфитредуцирующих клостридий и колифагов. Сульфитредуцирующие клостридии — спорообразующие анаэробные палочковидные микроорганизмы, редуцирующие сульфит натрия на железо-сульфитном агаре при температуре 44°С в течение 16—18 ч. Колифаги — бактериальные вирусы, способные лизировать Е. coli и формировать при температуре 37°С через 18 ч зоны лизиса бактериального газона (бляшки) на питательном агаре.

Санитарно-бактериологическое исследование воздуха.Количественные микробиологические методы исследования воздуха основаны на принципах осаждения (седиментации), аспирации или фильтрации.

Метод седиментации (метод Коха). Основан на оседании бактериальных частиц под влиянием силы тяжести на поверхности агара открытой чашки Петри. Для проведения метода Коха две чашки Петри с питательным агаром оставляют открытыми в течение 60 минут, после чего посевы инкубируют в термостате при 37ºС. Результаты оценивают по суммарному числу колоний, выросших на обеих чашках: при наличии менее 250 колоний воздух считается чистым, 250-500 колоний свидетельствует о загрязнении средней степени, при количестве колонии более 500 — загрязненным. Для обнаружения определенных видов микроорганизмов могут быть использованы специальные питательные среды: кровяной агар (гемолитические стафилококки и стрептококки), ЖСА (золотистый стафилококк). Однако метод оседания не дает полного количественного представления о микрофлоре воздуха, так как на открытых чашках плохо улавливаются тонкодисперсные фракции бактериальных капель и пылевых частиц. Поэтому метод оседания может быть использован в тех случаях, когда отсутствуют другие, более совершенные приборы и методы.

Аспирационный метод основан на ударном действии воздушной струи о поверхность питательной среды. Это более точный количественный метод определения микробного числа воздуха. Для исследования воздуха этим методом применяют аспирационный прибор Кротова. Аппарат Кротова устроен таким образом, что воздух с заданной скоростью засасывается через узкую щель плексигласовой пластины, закрывающей чашку Петри с питательным агаром. Воздух в количестве 50—100 л пропускают со скоростью 25 л в минуту над открытой чашкой с мясо-пептонным агаром или со специальной средой. Вращение столика с чашкой Петри обеспечивает равномерное распределение микроорганизмов по всей поверхности питательной среды. К концу заданного времени чашку с посевом воздуха снимают, закрывают ее и помещают в термостат. После инкубации посева в термостате проводят расчет микробного числа по формуле: ОМЧ = А х 1000/V, где А– количество выросших колоний на чашке, V — объем пропущенного через прибор воздуха, л, 1000 — стандартный объем воздуха в литрах. Допустим, на чашке при подсчете обнаружено 250 колоний, воздух пропускали 2 минуты со скоростью 25 л в минуту. Всего было пропущено 50 л воздуха. ОМЧ=250 х 1000/50=5000 (дм³).

Методы санитарно-бактериологических исследований объектов окружающей среды и воздуха в лечебных учреждениях проводятся в соответствии с МУК 4.2.2942-11, разработанные ФБУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора; ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора; ФБУН НИИ Дезинфектологии Роспотребнадзора и утверждены15.07.11.

Исследования бактериальной обсемененности воздушной среды проводят в помещениях лечебных организаций в зависимости от их функционального назначения на следующие санитарно-микробиологические показатели:

- общее количество микроорганизмов в 1 куб. м воздуха (КОЕ/куб. м);

- количество колоний S.aureus в 1 куб. м воздуха (КОЕ/куб. м);

- количество плесневых и дрожжевых грибов в 1 куб. м воздуха.

Пробы воздуха отбирают аспирационным методом с помощью аппаратов и устройств, разрешенных к применению в установленном порядке. Количество пропущенного воздуха должно составлять 100 куб. дм для определения общего количества микроорганизмов, дрожжевых и плесневых грибов и 250 куб. дм для определения S.aureus. Исследование воздуха седиментационным методом в лечебных учреждениях не допускается.

Для определения общего количества микроорганизмов в 1 куб. м воздуха забор проб проводят на питательный агар типа МПА, СПА, ГРМ-агар и другие, приготовленные согласно инструкциям по применению. Посевы инкубируют при температуре 37°С в течение 48 ч, подсчитывают количество выросших колоний и производят перерасчет на 1 куб. м воздуха. При наличии роста колоний дрожжевых и плесневых грибов их подсчитывают и делают пересчет на 1 куб. м воздуха. В протоколе количество дрожжевых и плесневых грибов указывают отдельно.

Для определения наличия S.aureus забор проб проводят на желточно-солевые среды на основе сред: элективно-солевой агар, стафилококк-агар, маннитол-агар, агар Байд-Паркер. Чашки с посевами инкубируют в термостате при 37 °С 48 ч. На вышеуказанных средах стафилококк растет в виде круглых, блестящих, маслянистых, выпуклых, пигментированных колоний. Следует учитывать, что стафилококки, выделенные от человека, дают положительную лецитовителлазную реакцию в 60 — 70% случаев. Отвивка на скошенный агар для дальнейшего исследования не менее 2 колоний, подозрительных на стафилококк. Для исследования отвивают прежде всего колонии, дающие положительную лецитовителлазную реакцию (образование радужного венчика). При отсутствии на чашках таких колоний дальнейшему исследованию подвергаются пигментированные колонии, схожие по морфологии со стафилококком. При одновременном наличии на чашках колоний стафилококка, отличающихся по пигменту, следует отвивать не менее двух колоний различного вида. Пробирки с посевом помещают в термостат при 37 °С на 24 ч. После инкубации у выделенных штаммов проверяют морфологию, тинкториальные свойства (окраска по Граму) и наличие плазмокоагулирующей активности в реакции плазмокоагуляции (РПК). Окраску по Граму проводят общепринятым методом. Под микроскопом окрашенные по Граму стафилококки имеют вид фиолетово-синих кокков, располагающихся гроздьями или небольшими кучками ("кружево"). Если культура обладает только плазмокоагулирующей или только лецитовителлазной активностью, то для окончательного ответа требуется учитывать другие признаки, позволяющие определить принадлежность штамма к виду S.aureus (ферментация маннита, гемолитическая активность). При необходимости, после выделения чистой культуры, проводят определение чувствительности/устойчивости к антибиотикам, дезинфицирующим средствам, бактериофагам.

Санитарно-бактериологическое исследование почвы. Отбор проб почвы. Исследование почвы проводят в соответствии методами микробиологического контроля почвы. Методические рекомендации. №ФЦ/4022. — 2004, разработанные сотрудниками Федерального научного центра гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана, Федерального центра госсанэпиднадзора Минздрава России, центра ГСЭН в Краснодарском крае, утвержденные 24.12.2004.

Санитарное состояние почвы — совокупность физико-химических, биологических свойств почвы, определяющих качество и степень ее безопасности в эпидемическом и гигиеническом отношении. Состав микрофлоры почвы меняется в зависимости от ее глубины. В поверхностном слое почвы (0 — 10 см) количество микроорганизмов незначительно; это связано с губительным действием прямого солнечного света и низкой влажности почвы. Максимальное количество микроорганизмов обнаруживается на глубине 10 — 30 см. На глубине 1 м выявляются единичные клетки бактерий. Наиболее богата микроорганизмами культурная возделываемая почва (до 5 млрд. клеток на 1 г почвы), наименее — почва, бедная влагой и органическими веществами (200 млн. клеток в 1 г).

Оценка санитарного состояния почвы проводится по результатам анализов почв на объектах повышенного риска (детские сады, игровые площадки, зоны санитарной охраны и т.п.) и в санитарно-защитных зонах по санитарно-бактериологическим показателям, которые делятся на косвенные и прямые:

1) Косвенные характеризуют интенсивность биологической нагрузки на почву. Это — санитарно-показательные микроорганизмы: бактерии группы кишечной палочки (общие колиформные бактерии) и энтерококки. В крупных городах с высокой плотностью населения биологическая нагрузка на почву очень велика и, как следствие, высоки индексы санитарно-показательных микроорганизмов, что наряду с санитарно-химическими показателями (динамика аммиака и нитратов, санитарное число) свидетельствует о неблагополучии и создании повышенного риска инфицирования. На свежее фекальное загрязнение почвы указывает наличие высокого индекса БГКП при низких титрах нитрификаторов, термофилов, а также относительно высокое содержание вегетативных форм C. perfringens. Обнаружение энтерококков всегда свидетельствует о свежем фекальном загрязнении, каковы бы ни были другие показатели.

2) Прямые санитарно-бактериологические показатели эпидемической опасности почвы — обнаружение возбудителей кишечных инфекций (патогенные энтеробактерии, энтеровирусы).

О возможности загрязнения почвы патогенными энтеробактериями свидетельствует индекс санитарно-показательных микроорганизмов БГКП (колиформ) и энтерококков 10 и более клеток/г почвы.

При необходимости углубленной оценки санитарного состояния почвы и способности ее к самоочищению исследуются показатели биологической активности почвы. Основными интегральными показателями биологической активности почвы являются: общая микробная численность (ОМЧ), клостридии, термофильные бактерии, грибы и актиномицеты, аммонификаторы, аэробные целлюлозные микроорганизмы и т.д.

Перечень показателей определяется целями исследования, природой и интенсивностью загрязнения, характером землепользования. Контроль загрязнения почв населенных пунктов проводится с учетом функциональных зон города. Места отбора проб предварительно отмечаются на картосхеме, отражающей структуру городского ландшафта. Отбор проб осуществляется согласно ГОСТ 17.4.4.01-83 "Общие требования к отбору проб почвы"; ГОСТ 17.4.4.02-84 "Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического, гельминтологического анализа". На территорию, подлежащую контролю, составляют описание с указанием адреса, точки отбора, общего рельефа микрорайона, расположения мест отбора и источников загрязнения, растительного покрова, характера землепользования, уровня грунтовых вод, типа почвы и других данных, необходимых для правильной оценки и трактовки результатов анализов образцов.

Отбор проб для бактериологического анализа проводится не менее 1 раза в год в местах возможного нахождения людей, животных, в местах загрязнения органическими отходами. При изучении динамики самоочищения почвы отбор проводят в течение первого месяца еженедельно, а затем ежемесячно в течение вегетационного периода до завершения активной фазы самоочищения.

Пробная площадка — часть исследуемой территории, характеризующаяся сходными условиями (рельефом, однородностью структуры почвы и растительного покрова, характером хозяйственного использования). Пробная площадка должна располагаться на типичном для изучаемой территории месте. На площади 100 кв. м закладывается одна пробная площадка размером 25 м. При неоднородности рельефа площадки выбирают по элементам рельефа.

Точечная проба — материал, взятый из одного места горизонта или одного слоя почвенного профиля, типичный для данного горизонта или слоя. Точечные пробы отбирают на пробной площадке из одного или нескольких слоев или горизонтов методом конверта. Точечные пробы отбирают ножом, шпателем или почвенным буром. Объединенную пробу составляют путем смешивания точечных проб, отобранных на одной пробной площадке.

Для бактериологического анализа с одной пробной площадки составляют 10 объединенных проб. Каждую объединенную пробу составляют из трех точечных проб массой от 200 до 250 г каждая, отобранных послойно с глубины от 0 до 5 см, от 5 см до 20 см.

Пробы почвы, предназначенные для бактериологического анализа, в целях предотвращения их вторичного загрязнения следует отбирать с соблюдением правил асептики: отбирают стерильными инструментами, перемешивают на стерильной поверхности, помещая в стерильную тару. Время от отбора проб до начала их исследования не должно превышать 1 суток.

Отобранные пробы необходимо пронумеровать и зарегистрировать в журнале, указав следующие данные: порядковый номер и место взятия пробы, рельеф местности, тип почвы, целевое назначение территории, вид загрязнения, дату отбора. Пробы должны иметь этикетку с указанием места и даты отбора пробы, номера почвенного разреза, почвенной разности, горизонта и глубины взятия пробы, фамилии исследователя.

Для приготовления среднего образца объемом 0,5 кг почву всех образцов одного участка высыпают на стерильный, плотный лист бумаги, тщательно перемешивают стерильным шпателем, отбрасывают камни и прочие твердые предметы. Если проба почвы однородна, допускается тщательное перемешивание почвы в банке. Затем почву распределяют на листе ровным тонким слоем в форме квадрата. Диагоналями почву делят на 4 треугольника. Почву из двух противоположных треугольников отбрасывают, а оставшуюся вновь перемешивают, опять распределяют тонким слоем и делят диагоналями и так до тех пор, пока не останется примерно 0,5 кг почвы. Перед посевом почву просевают через сито диаметром 3 мм.

Образец почвы тщательно перемешивают и из него отбирают навески, величины которых выбираются исходя из предполагаемой степени загрязнения почвы и планируемых определений. Для учета почвенных микроорганизмов достаточно навески от 1 до 10 г. В навеску почвы добавляют небольшое количество стерильной водопроводной воды до получения пастообразного состояния почвы, растирая ее в течение 5 минут. Из суспензии делают раститровку. Первое разведение навески почвы (1:10) делают в стерильной посуде, добавляя к суспензии стерильную водопроводную воду в соотношении 1:9 к весу почвы (например: 1 г почвенной суспензии разводят в 9,0 мл стерильной водопроводной воды, 10 г почвы — в 90,0 мл воды и т.д.). Приготовленные разведения используются для посева на различные питательные среды, а также для учета численности микроорганизмов методом прямой микроскопии.

Бактерии группы кишечной палочки (БГКП) давно уже считаются удобными микробными индикаторами. Показатель "бактерии группы кишечных палочек" приведен в соответствие с принятой международной номенклатурой, который идентичен показателю "общие колиформные бактерии". К колиформам относятся грамотрицательные бактерии, имеющие форму палочек, способных развиваться в присутствии солей желчных кислот или других поверхностно-активных агентов с аналогичной способностью к подавлению роста и способных ферментировать лактозу при 35 — 37 °C с образованием кислоты, газа и альдегида, то есть на среде Эндо лактозоположительные колонии дают отпечаток в течение 24 — 48 ч. Они оксидазоотрицательные и не образуют спор. Бактерии группы кишечной палочки включают следующие роды: эшерихия, клебсиелла, энтеробактер, цитробактер и серрации.

При анализе почв, для которых предполагается невысокая степень фекального загрязнения, рекомендуется проводить определение титрационным методом и в качестве ускоренного метода для анализа слабозагрязненных почв рекомендуется использовать метод мембранной фильтрации (см.выше). При анализе загрязненных и сильно загрязненных почв, отобранных в местах интенсивного фекального загрязнения, рекомендуется проводить прямой поверхностный посев почвенной суспензии в количестве 0,1 или 0,2 мл на поверхность среды Эндо и немедленно равномерно распределять по поверхности шпателем. Посевы выращивают в термостате при 37 °C в течение 24 ч. Следующий этап исследований заключается в идентификации выросших микроорганизмов, который проводится аналогично определению общих колиформных бактерий титрационным методом и подсчету количества колиформных бактерий в 1 г почвы, для чего среднее число колиформных колоний, выросших на чашке, умножается на степень десятикратного разведения.

Кроме того, в почве проводят определение энтерококков и C.perfringens. Энтерококки — грамположительные, не образующие каталазу кокки, слегка вытянутые, с заостренными концами, располагающиеся в виде диплококков или коротких цепочек, реже одиночными кокками. Полиморфны. При росте на жидких средах (ЛПС — лактозо-пептонная среда, ЩЭС — щелочно-полимиксиновая среда) вызывают диффузное помутнение и образование осадка. Определение энтерококков также проводится титрационным и фильтрационным методом с использованием специальных сред.

Сульфитредуцирующие клостридии — спорообразующие анаэробные палочковидные микроорганизмы, редуцирующие сульфит натрия на железосульфитном агаре при температуре 44°С в течение 16 — 18 ч. Метод основан на выращивании посевов в железосульфитном агаре (Вильсон-Блера) в условиях, приближенных к анаэробным, и подсчете числа черных колоний.

Определение общей численности почвенных микроорганизмов (ОМЧ). После титрования исследуемой почвы, из каждого разведения делают посев не менее двух объемов по 0,1 или 0,2 мл на поверхность почвенного агара, разлитого в стерильные чашки Петри, и равномерно шпателем растирают по всей поверхности чашки. Термостатирование засеянных чашек ведут при 28-30 °C в течение 72 ч. Учет результата: количество колоний на обеих чашках суммируют, делят на два и умножают на степень разведения. Результат выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 г.

В почве также определяют количество актиномицетов и грибов.

Актиномицеты (греч. Actis — луч, mucos — гриб) — одноклеточные микроорганизмы, тело состоит из нетитрованного мицелия, который имеет вид ветвящихся тонких нитей. У актиномицетов, как и у бактерий, генетическую функцию выполняет нуклеоид. В нитях мицелия находятся зерна хроматина. Размножаются актиномицеты при помощи специальных органов плодоношения, путем прорастания спор, прикрепленных на спороносцах, простым делением, перешнурованием и почкованием. Актиномицеты — факультативные анаэробы, хорошо развиваются при 25 — 30 °C (оптимальная температура 35 — 37 °C) на плотных средах. Одни виды растут с образованием плотных гладких колоний, другие имеют складчатые, бугристые, корковидные, бархатистые, пушистые или мучнистые колонии, которые срастаются со средой и с трудом снимаются петлей. Актиномицеты могут быть бесцветными или пигментированными (синие, фиолетовые, красные, желтые, оранжевые, зеленые и т.д.), на плотных питательных средах часто образуют воздушный мицелий, на концах которого развиваются споры, придающие колониям определенный цвет.

Среди грибов встречаются сапрофиты и паразиты. Наибольшее значение для медицины представляют оомицеты (Oomycetus), аскомицеты (Ascomycetes), базидиомицеты (Basidiomycetes), дейтеромицеты (Deuteromycetes), форма клеток у молодых культур может быть круглая, яйцевидная или удлиненная, у зрелых клеток — грушевидная, булавовидная, веретенообразная, амебовидная. Основным структурным компонентом клеток грибов является мицелий, состоящий из разветвленных бесцветных нитей (гиф). У одних видов он состоит из нерасчлененной клетки (mucor), у других (высших грибов) он многоклеточный; у дрожжеподобных грибов (Candida) имеется псевдомицелий.

Установлена большая чувствительность почвенных актиномицетов и грибов к действию отдельных химических веществ по сравнению с почвенными споровыми и неспоровыми бактериями. Несомненно, что такая разбалансировка равновесия в почвенном микробиоценозе должна рассматриваться как отрицательное явление. Актиномицетам и грибам принадлежит большая роль в превращении широкого круга органических и минеральных веществ. Благодаря чрезвычайно выраженным антагонистическим и токсическим свойствам они оказывают большое влияние на формирование микробных почвенных биоценозов, являются продуцентами многих физиологических активных веществ: аминокислот, ферментов, витаминов.

Определение аммонификаторов в почве. Аммонифицирующие микроорганизмы принимают участие в расщеплении белковых соединений до аммиака. Их учитывают на мясо-пептонном агаре, а при необходимости на жидких пептонных средах (мясо-пептонный бульон, пептонная вода) с индикаторными бумажками, определяющими аммиак. Для определения выделяющегося аммиака над средой в пробирке подвешивают красную лакмусовую бумажку (при выделении аммиака она синеет) или полоски фильтровальной бумаги, пропитанные реактивом Круппа (от аммиака краснеют). При выращивании почвенных суспензий на мясо-пептонном агаре результаты выражают в КОЕ (колониеобразующих единицах) на 1 г почвы. При определении этого показателя в жидких средах определяют титр, индекс аммонифицирующих микроорганизмов по последней пробирке, в которой еще обнаруживается аммиак (на 10-е сутки) после термостатирования при температуре 25-30 °C.

Определение патогенных энтеробактерий родов Salmonella и Shigella в 1 г почвы. Сущность определения шигелл и сальмонелл заключается в использовании методов накопления патогенных бактерий в средах обогащения с последующим пересевом на плотные селективные и дифференциальные среды с последующим изучением биохимических свойств выделенных культур и их серологическую идентификацию по методике.

Используют не менее двух сред накопления из перечисленных: среду Мюллера Кауфмана, селенитовый бульон, магниевую среду, тетратионатовый бульон. Для сальмонелл используют любые две среды из четырех, для шигелл — селенитовую среду. Посевы инкубируют при 37°C в течение 18-24 часов, затем из каждого флакона делают высевы бактериологической петлей на чашки с плотными селективными средами: для сальмонелл — на висмут-сульфитный агар, для шигелл на бактоагар Плоскирева, среду Эндо. Чашки с посевами инкубируют при температуре 37°C в течение 18 — 20 часов, а в случае отсутствия роста чашки с посевами оставляют еще на 24 часа в термостате. С каждой чашки снимают подозрительные на сальмонеллы и шигеллы колонии в пробирки с дифференциально-диагностическими средами. Окончательное определение биохимических и серологических свойств, био- и сероваров проводят по действующим МУ 17.04-23/307-84 "Микробиологическая диагностика заболеваний, вызываемых энтеробактериями".

III. План практической работы

1. Определить коли-индекс воды:

а) бродильным методом

б) методом мембранных фильтров

2. Определить микрофлору воздуха:

а) седиментационным методом

б) аспирационным методом

3. Определить ОМЧ воды, воздуха и почвы

4. Заполнить таблицу по теме занятия

5. Решить ситуационные задачи

IV. Примеры ситуационных задач