Нейрофизиологические, биохимические, поведенческие и энергетические паттерны при формировании и инволюции ФМА
Известно, что одним из валидных нейрофизиологических критериев ФМА является межполушарная разность уровня постоянного потенциала (УПП) головного мозга – это показатель типа и выраженности ФМА (В.Ф. Фокин с соавт, 1982; 1986). Было показано, что различие УПП в больших полушариях головного мозга крыс не менее чем на 2 мВ является признаком выраженной латерализации животного (правшества или левшества), а отсутствие этого межполушарного различия УПП свидетельствует об амбидекстрии (Л.Л. Клименко с соавт., 1987; 1998; 1999). Постоянные потенциалы милливольтного диапазона характеризуют стационарную систему управления (в отличие от оперативной, маркером которой является ЭЭГ, регистрирующая постсинаптические потенциалы микровольтного диапазона). Основной вклад в генерацию УПП вносят потенциалы гематоэнцефалического барьера и в меньшей мере мембранные потенциалы нервных и глиальных клеток; в связи с этим фактом УПП принято считать интегральным отражением мембранных потенциалов сосудистого и нейроглиального происхождения (R. Gumnit, 1974; G.G. Somjen et al. 1979; Дж. Дудел с соавт., 1985). Генерация мембранных потенциалов связана с энергозатратами, необходимыми для создания и поддержания ионных градиентов, функционирования К-Nа насоса и др. Данные экспериментальных исследований свидетельствуют о связи величины постоянного потенциала головного мозга с показателями энергетического обмена: с потреблением кислорода и глюкозы, накоплением гликогена, концентрацией АТФ и других энергетических метаболитов, а также с соотношением окисленных и восстановленных форм дыхательных ферментов NАD-NАDН и с интенсивностью реакций свободнорадикального окисления липидов мембран головного мозга (A.L. Hodgkin, 1964; S.D.Glick еt al., 1977; A. Lehmenkuhler, 1979; В.Ф. Фокин с соавт., 1994; Hansen A.J., 1985; F. Van Bel et al., 1998; Биохимия мозга под ред. И.П. Ашмарина, 1999). Совокупность этих данных позволяет рассматривать УПП как меру интенсивности энергетического метаболизма в ЦНС.
Согласно современным представлениям, рост, развитие и старение организма (приближение к конечному равновесному состоянию) сопровождается уменьшением энергетического метаболизма, определяемого по интенсивности потребления кислорода, концентрации АТФ в клетках или по энергетическому заряду Аткинсона (соотношение концентрации АТФ, АДФ и АМФ). При этом в мозге происходят характерные изменения его интегративной деятельности, одним из ведущих механизмов которой является функциональная межполушарная асимметрия (ФМА) (О.С. Адрианов, 1976; В.В. Фролькис, 1991; В.В. Абрамов, 1991).
Исследование нейрофизиологических, биохимических, энергетических и поведенческих характеристик в процессе формирования и старения системы ФМА было разделено на два этапа. Первый этап включал в себя определение моторной асимметрии, регистрацию и анализ УПП, измерение концентрации гидроперекисей, Шиффовых оснований фосфолипидов и липофусцина в полушариях головного мозга крыс разного возраста. На втором этапе исследования после определения моторной асимметрии у крыс регистрировали УПП в моторной области коры каждого полушария и параллельно измеряли температуру коры в той же области. На первом этапе работа была выполнена на 200 белых крысах - самцах в возрастном диапазоне от 3 до 34 месяцев, на втором этапе в эксперименте было использовано 53 крысы в возрастном диапазоне от 3 до 25 месяцев. Поведенческие эксперименты проводили в Т-образном лабиринте. Животных тестировали по побежкам: если из 10 побежек животное осуществляло 8 и более поворотов в одну сторону, его относили к группе, латерализованной по поведению - правшей или левшей, в зависимости от стороны поворота, остальных животных относили к амбидекстрам. Моторная асимметрия оценивалась по коэффициенту асимметрии, вычисляемому по формуле: Кас=|Ппр-5|, где Ппр- количество побежек направо.
Перед регистрацией УПП животных наркотизировали этаминалом натрия из расчета 0,34 мг на 100 г массы. После окончания острого опыта находящихся под наркозом крыс декапитировали.
Постоянные потенциалы отводили от твердой мозговой оболочки в лобных областях каждого полушария неполяризуемыми хлорсеребряными электродами с сопротивлением 10 кОм. Регистрировали УПП с помощью электрометра с входным сопротивлением 1014Ом. Характеристикой ФМА служила разность в значениях УПП в лобных областях каждого полушария Δ=(Fd-Fs), мВ.
Определение концентрации продуктов свободнорадикалъного окисления гидроперекисей (ГП) и Шиффовых оснований фосфолипидов (ШО) проводили в экстрактах фосфолипидов из каждого полушария в отдельности согласно методике, описанной ранее (Л.Л. Клименко с соавт., 1987). Концентрацию пигмента старения липофусцина определяли иначе - не в экстрактах фосфолипидов, а в гомогенатах коры головного мозга методом синхронного сканирования люминесценции (Я. Рабек, 1985) с помощью спектрофлуориметра Hitachi МРF-4. Параметром, характеризующим накопление липофусцина в коре, служило отношение интенсивности флуоресценции липофусцина (λmax=440 нм) к интенсивности флуоресценции триптофанила (λmax=340 нм). Таким образом, содержание липофусцина нормировалось на содержание белка в пробе. Температуру в моторной области коры полушарий измеряли с помощью констатан-манганиновых термопар, соединенных с компьютерно - измерительной системой "Аксамит" (Л.Л. Клименко, 2000).
Результаты первого этапа исследования отражены на графиках (рис. 1)
Рис. 1. Динамика уровня постоянного потенциала (а), гидроперекисей (б), Шиффовых оснований фосфолипидов (в) и липофусцина (г) в полушариях головного мозга крыс в процессе старения. Динамика коэффициента асимметрии поведения в Т-образном лабиринте (д).
Динамика уровня постоянного потенциалав возрастном диапазоне от 3 до 34 месяцев представлена М-образной кривой, имеющей два максимума. Постоянный потенциал головного мозга имеет максимальные значения в возрасте 10 и 28 месяцев, минимальные - в возрасте 3 и 21 месяц. Существенно при этом, что значения УПП в полушариях различаются в течение всего исследованного периода, т.е. в процессе онтогенеза между полушариями имеется существенная разница в интенсивности энергетического обмена (рис. 1 - а).
Динамика гидроперекисей, Шиффовых оснований фосфолипидов и липофусцинав полушариях головного мозга крыс представлена на графиках (рис. 1 - б, - в, - г). Все кривые имеют многофазный характер и концентрация исследованных продуктов ПОЛ различается в полушариях в течение всего периода онтогенеза. Графики, описывающие динамику ГП в полушариях, имеют два переломных момента, приходящиеся на молодой (10 мес.) и зрелый (20 мес.) возраст. Динамика конечных продуктов ПОЛ - Шиффовых оснований фосфолипидов также имеет сходный с динамикой ЛФ многофазный характер. Очевидное сходство динамических кривых ЛФ и ШО вполне объяснимо, так как в состав ЛФ входят соединения типа Шиффовых оснований, которые люминесцируют в той же области, что и ЛФ. Несмотря на традиционное представление о ЛФ, как о пигменте старения, накопление ЛФ - немонотонная функция возраста: скорость накопления различна в полушариях и максимальна в молодом возрасте. В правом полушарии скорость накопления ЛФ в период от 3 до 9 месяцев в 16,8 раза выше, чем в зрелом возрасте - от 9 до 20 месяцев. Такое большое различие в скорости накопления ЛФ в разные периоды онтогенеза ассоциируется как с высокой интенсивностью свободнорадикальных реакций - "в молодости старение идет быстрее" (Age pigments, 1981).,– так и с высокими затратами энергии, сопровождающими созревание мозга. Существует мнение, что ЛФ - это внутриклеточное депо кислорода (S. Bjorkerud, 1964; В.Н. Карнаухов, 1973), а его накопление и утилизация в процессе онтогенеза - это приспособление к гипоксии в молодом и старческом возрасте. Известно, что в процессе онтогенеза существует ряд критических периодов, связанных с созреванием мозга, когда значительно меняется его деятельность. Эти периоды соответствуют основным периодам жизни: достижения половой зрелости, репродуктивному и периоду угасания репродуктивной функции.
С этими периодами совпадают изменения в активности защитных ферментных систем, под контролем которых протекают процессы свободнорадикального окисления. Многофазность динамических кривых связана с соответствующими возрастными изменениями активности защитных ферментов. Ряд исследователей показал (K. Nandy, 1978; Tolmasoff J.М. et al., 1980; D. Roy et al., 1983), что СОД и ферментная система глутатион-трансфераза - глутатион-редуктаза в процессе онтогенеза претерпевают изменения активности, которые можно описать М-образной кривой, при этом переломные моменты этой кривой приходятся на те же возрастные периоды, что и в наших графиках. Объектом исследований возрастных изменений активности защитных ферментов был у этих авторов, как и в наших опытах, головной мозг крыс.
Многофазная динамика УПП, синхронизированная с таковой же всех исследованных продуктов, также находит объяснение в возрастных изменениях активности защитных ферментов. Действительно, изменение электрического сопротивления мембран и нарушение их барьерных функций, происходящие под влиянием свободнорадикального окисления липидов мембран головного мозга и под контролем защитных ферментов, не может не отразитъся на интегральном мембранном потенциале, каким является УПП.
Межполушарный различия, наблюдаемые во всех возрастных периодах и для всех продуктов свободнорадикального окисления, включая липофусцин, ассоциируется с представлением о различии в скорости старения полушарий. Благодаря тому, что в течение всего периода онтогенеза поддерживается концентрационный градиент свободных радикалов, можно сказать, что в полушариях головного мозга часы старения идут с разной скоростью.
Моторная асимметрия животных ранее, чем другие виды асимметрий привлекла внимание исследователей (R.L. Collins 1968; 1975; 1985; 1991; S.D. Glick et al., 1977; В.Ф. Фокин, 1982; J. Cenracec, 1991), однако механизм ее возникновения и связь с нейрофизиологическими, а тем более с биохимическими процессами, протекающими в полушариях головного мозга, долгое время не была исследована. Однако поведение – это высший иерархический уровень всего каскада адаптивных реакций, поэтому механизм возникновения моторной асимметрии, которая принимает самое непосредственное участие в осуществлении процесса выбора, нуждается в пристальном внимании.
На поведенческом уровне ФМА отражена в динамике коэффициента асимметрии, характеризующем поведение крыс в Т-образном лабиринте (рис. 1, д). Исходя из представления о сопряженности нейрофизиологических и биохимических процессов (постоянного потенциала и свободнорадикального окисления) в полушариях головного мозга, можно объяснить наличие двух максимумов (в 3 и 24 месяца) на графике зависимости коэффициента асимметрии от возраста. Эти возрастные периоды характеризуются недостаточной сбалансированностью процессов ПОЛ с процессами утилизации токсичных продуктов, связанной с низкой активностью ферментов защиты в молодом и позднем возрасте, что в свою очередь может приводить к большей биохимической и электрофизиологической асимметрии полушарий и, как следствие, к большей латерализации поведения. Корреляционный анализ выявил наличие достоверных связей между параметрами поведенческого, нейрофизиологического и биохимического уровней системы ФМА (Л.Л. Клименко 1986, Л.Л. Клименко с соавт, 1998).
Таким образом, поведенческий акт формируется под многоуровневым контролем, а взаимная сопряженность уровней, их иерархическое соподчинение и соблюдение количественных взаимоотношений между ними позволяет рассматривать ФМА как систему, обеспечивающую оптимизацию адаптивных реакций организма в течение всего периода онтогенеза.
Рисунок 2.
Динамика уровня постоянного потенциала в правом (а) и левом (б) полушариях. Динамика асимметрии распределения постоянного потенциала (в) и коэффициента моторной асимметрии (г).
Очевидно, что поддержание межполушарной разности УПП, а также биохимических межполушарных различий не может происходить без соответствующих энергозатрат, таким образом, энергетический аспект формирования и поддержания ФМА оставался открытым. В связи с этим обстоятельством возник ряд вопросов. Что стоит за асимметрией распределения постоянного потенциала? Различается ли энергетический гомеостаз полушарий так же, как различаются параметры нейрофизиологического и биохимического уровней?
Рис. 3. Температурная динамика в правом (а) и левом (б) полушариях. Динамика температурной асимметрии (в) и энергозатрат мозга (д) в онтогенезе.
Таким образом, мы подошли к заявленному ранее вопросу о метаболической, а следовательно, об энергетической цене выбора. Для ответа на поставленные вопросы был выполнен второй экспериментальный этап исследования, при котором одновременно регистрировались УПП и температура в моторной области коры каждого полушария.
Результаты второго этапа представлены на графиках (рис. 2 и 3), из анализа которых следует: температура коры полушарий и УПП в процессе старения претерпевают синхронные многофазные изменения.
Динамику температуры, как и динамику УПП, можно разделить на три фазы: фазу быстрого роста (от 1 до 5 месяцев), фазу резкого уменьшения (от 5до 6 месяцев) и фазу стабилизации с постепенным ростом температуры и потенциала (от 6 до 25 месяцев) (рис. 2 (а, б); рис. 3 (а, б)). Эти периоды соответствуют определенным этапам формирования коры головного мозга: до 5 месяцев происходит образование новых клеток и связей, что сопровождается высоким уровнем энергообмена; в позднем возрасте вторичное повышение температуры связано с катаболическими процессами, идущими с высвобождением энергии.
Это повышение можно назвать пассивным, связанным с процессом утилизации энергии. Полученные динамические кривые в значительной степени совпадают с динамикой концентрации АТФ и потребления кислорода в различных органах и тканях белых крыс в процессе онтогенеза. При исследовании ректальной температуры мышей в процессе онтогенеза аналогичную температурную динамику авторы связывают с возрастным изменением гормонального статуса и метаболизма (M.J. Talan et al., 1986). Как видно из графиков, на которых представлены показатели температурной асимметрии полушарий и межполушарная разность потенциалов, УПП и температура в полушариях различаются во всех возрастных периодах (рис. 2- в; рис. 3- в). Этот факт можно рассматривать как показатель различной интенсивности энергообменных процессов в полушариях, поскольку оба исследуемых параметра являются мерой энергетического метаболизма.
Максимальных значений асимметрия распределения УПП, как и температурная асимметрия, достигает в 5 и 25 месяцев. В ряде работ (В.И. Пасечник, 1987; И.А. Шевелев с соавт, 1987) был проведен расчет теплопродукции (количества энергии), обеспечиваемой метаболизмом, в условной единице коры головного мозга (площадью 1мм2). Эти расчеты показали, что увеличение температуры коры в результате изменения метаболической активности или локального кровотока в элементарном объеме коры на 0,10 соответствует теплопродукции величиной 10-4 Вт или (10 х 0,239-4) калорий.
0,239х10-4 Кал х ΔТ°/ 0,1° (1)
Используя эти расчеты, можно определить энергетическую цену поддержания межполушарной асимметрии, изменяющуюся на протяжении всей жизни. Между постоянным потенциалом и температурой в различных возрастных группах существует достоверная корреляционная связь, максимальное количество связей приходится на возраст 15 месяцев. Понятно, что наибольшие энергетические траты приходятся на период наиболее выраженной межполушарной асимметрии.
Таким образом, очевидно, что информационные, энергетические и пластические процессы в ЦНС крыс связаны в единую систему межполушарной асимметрии. Параметры, характеризующие биологические уровни этой системы, синхронно и взаимосвязанно изменяются в процессе старения. Маркеры энергетического метаболизма коры больших полушарий головного мозга – постоянный потенциал и температура – претерпевают в позднем онтогенезе многофазные изменения, качественно сходные в обоих полушариях, но различающиеся количественно. Этот факт можно рассматривать как одно из объяснений асимметрии старения полушарий, показанной ранее. Выявленная многофазность динамики уровня постоянного потенциала, концентрации продуктов ПОЛ и температуры коры головного мозга ассоциируется со сменой типов регулирования обменных процессов и церебральных функций, обеспечивающих гомеостаз в разные периоды жизни.
Изложенные результаты свидетельствуют о том, что УПП является не только маркером интенсивности метаболизма и показателем энергетического гомеостаза мозга, но также характеризует тип межполушарной асимметрии, вносящей принципиальный вклад в организацию поведенческого акта. Таким образом, УПП представляет собой ключевой показатель, объединяющий нейрофизиологический, биохимический и поведенческий уровни межполушарной асимметрии.
При этом очевидно, что в формировании системы ФМА принимают участие и показатели других, более низких уровней биологической организации. Известно, что в энергетическом метаболизме мозга принимают участие металлоферменты, обладающие высокой биологической активностью.