Непрямой иммунофлюоресцентный метод
При использовании непрямого ИФМ для обнаружения антител к бруцеллам заранее готовят мазки из 1-2 суточной агаровойкультуры возбудителя (1 x 109 мкл/мл). На одном предметном стекледелают 8 мазков, фиксируют их в этиловом спирте в течение 30 мин.,высушивают на воздухе и помещают во влажную камеру. Исследуемуюсыворотку разводят 2-кратно, начиная с разведения 1:2 до 1:320, и наносят пастеровской пипеткой на мазки, начиная с большего разведения. Влажную камеру с препаратом помещают в термостат при370С на 30 мин. Мазок отмывают от несвязавшихся антител и после подсыхания его вновь помещают во влажную камеру, докрашивая антивидовой люминисцирующей сывороткой в рабочем разведении.
Дальнейшая обработка препарата ведется, как при прямомиммуннофлюоресцентном методе. После просмотра препарата под люминесцентным микроскопом устанавливают титр антител в исследуемой сыворотке.
В качестве контролей служат препараты, в которых бруцеллы обработаны бруцеллезной сывороткой (положительный контроль) и сывороткой, не содержащей антитела к бруцеллам (отрицательный контроль). Диагностическим титром считается титр не менее 1:4.
Тесты, выявляющие повышеннуюсенсибилизацию организма к бруцеллезному антигену
Кожно-аллергическая проба Бюрне
Внутрикожная аллергическая проба основана на способности организма, сенсибилизированного бруцеллезным антигеном, специфически отвечать местной реакцией (отек, болезненность) навнутрикожное введение бруцеллезного аллергена. Реакция специфична, но выявляется у больных позднее, чем антитела, и сохраняется очень долго, иногда годами,после исчезновения клинических симптомов.
Необходимо иметь в виду, что аллергическая реакция может быть положительной в случаях бессимптомной инфекции, а также у привитых живой бруцеллезной вакциной и у лиц, длительно контактировавших со специфическим антигеном.
Техника постановки пробы. Бруцеллезный аллерген вводится внутрикожно в количестве 0,1 мл. Инъекция делается с соблюдением асептики на ладонной поверхности предплечья шприцом с тонкой иглой (техника, тождественная реакции Манту, Шика и Дика). Учет реакциипроизводится через 24-48 часов после введения аллергена путем осмотра и ощупывания кожи. В некоторых случаях аллергическаяреакция становится положительной к 72 часам.При положительной реакции на месте введения аллергена появляется красноватая или бледная болезненная отечностьудлиненной или овальной формы. Отек может быть хорошо контурирован с ясным возвышением над уровнем нормальной кожи. При слабо выраженной реакции отек распознается только при ощупывании (сравнить с аналогичным участком кожи на другой руке). Гиперемию кожи при отсутствии отека принимают за отрицательный результат.При учете реакции отмечается размер отека в сантиметрах (длина и ширина), степень болезненности через 24 и 48 часов. При отрицательном результате следует учитывать реакцию и через 72 часа.
Оценка реакции. Наличие выраженного отека кожи на месте введения аллергена считается положительной аллергической реакцией. Отсутствие болезненности и гиперемии при наличии отека не исключаетположительной оценки пробы. Реакция, появившаяся и исчезнувшая ранее шести часов послевведения аллергена, считается неспецифической.
У людей, высокосенсибилизированных к бруцеллезному антигену, возможна общая реакция организма на введение бруцеллина с повышением температуры, ознобом, головной болью и недомоганием. Оценка реакции: слабо положительная – слабо выраженный отек не более 2 см в диаметре, положительная – отек размером от 2 до 6 см в диаметре, резко положительная – отек свыше 6 см, иногдасопровождающийся лимфааденитом и общей реакцией организма. [14]
Реакция лизиса лейкоцитов
Введение специфического антигена в сенсибилизированный организм небезразлично для обследуемого. В этой связи заслуживаетвнимания эффективный метод выявления гиперчувствительности замедленного типа методом in vitro с помощью реакции лизисалейкоцитов (РЛЛ). РЛЛ основана на учете разрушения лейкоцитов сенсибилизированного организма под влиянием специфического антигена, регистрируемого методом in vitro. РЛЛ обладает строгойспецифичностью, дает возможность количественного учета степени сенсибилизации организма, позволяет получить ответ через 3-4 часа после взятия крови.
Техника постановки РЛЛ. РЛЛ проводится в пробирках из химически чистого стекла. В качестве антигена используется взвесь убитых нагреванием бруцелл (может быть использован вакцинный штамм B.abortus 19BA) в концентрации 1 x 107мкл/мл.
Кровь для исследования берется в количестве 1 мл и вносится вколбочку с гепарином из расчета 75-80 ме гепарина на 1 мл крови.По 0,4 мл гепаринизированной крови помещается в 2 пробирки. В первую пробирку добавляют 0,1 мл бруцеллезного антигена (опытная пробирка), во вторую – 0,1 мл физраствора для установления неспецифического лизиса лейкоцитов (контрольная пробирка).
Пробирки встряхивают в течение 2-3 мин., после чего проводятподсчет лейкоцитов в камере Горяева по принятому в гематологии методу. Затем пробирки помещают в термостат на 2 часа при 370С и периодически встряхивают их через 15-20 мин. После инкубациипробирки вновь встряхивают в течение 2-3 мин. и проводят подсчет лейкоцитов. Подсчет производится не менее 2-3 раз для каждой пробирки, а затем выводится среднее их количество. Наличие лейкоцитов после инкубации в опытной и контрольной пробирках подсчитывается по формуле: количество лейкоцитов после инкубации x 100% количество лейкоцитов до инкубации.
Показатель специфического лизиса лейкоцитов (ПСЛ) подсчитывается путем определения разницы – процент уменьшения лейкоцитов в опытной пробирке минус процент уменьшения лейкоцитов в контроле. ПСЛ выражается отрицательной величиной и колеблется в пределах от -10 до -30%. ПСЛ меньше -10% свидетельствует о неспецифическом лизисе. [16]