Глава 24. методы консервации с применением эфирных масел

В 1963 г. в окрестностях Рима был обнаружен саркофаг с телом молодой девушки, погребенной около 1800 лет назад. Когда саркофаг вскрыли, присутствующие были поражены хорошо сохранившимися мягкими тканями, бровями, ресницами, волосами, заплетенными в косу. От мумии исходил аромат. Впоследствии выяснилось, что одним из основных компонентов бальзамического состава, обладающего большой бактерицидной активностью, был эвкалипт.

Консервирующее действие бальзамических веществ на ткани умерших в течение тысячелетий поражало современников своей эффективностью.

В наше время появились новые задачи, связанные с проблемой консервации клеток крови и тканей различных органов, продуктов жизнедеятельности человека, пищевых продуктов, воды и т.д.

Консервация крови. Консервация клеток крови и тканей человека стала в нашем столетии актуальной проблемой биологии и медицины. Большое значение придается изысканию консервантов, обеспечивающих морфологическую и функциональную целость клеток после длительного консервирования.

Проблема консервирования крови и ее клеточных компонентов развивается в последние десятилетия в двух направлениях: усовершествование методов консервирования при положительных температурах (+4 °С) и разработка методов хранения клеток в замороженном состоянии. В первом направлении доминирует концепция возможно более длительного поддержания метаболизма в клетках, во втором — временной остановки обменных процессов, т.е. сохранения живых клеток в состоянии обратимого анабиоза.

Разработаны теоретические основы консервирования крови, которые способствовали созданию эффективных консервирующих растворов, позволяющих сохранять кровь при 4 °С до 3 нед в физиологически полноценном состоянии. Однако и в улучшенных консервантах уже к концу 3-й недели хранения крови при 4 °С эритроциты становятся метаболически неполноценными. В связи с этим продолжаются изыскания путей дальнейшего улучшения метаболического статуса эритроцитов при их хранении.

При всех известных методах консервирования неизбежно происходит потеря определенного количества ядросодержащих, в том числе живых, клеток.

Поиск дальнейших путей повышения эффективности методов консервации при положительных температурах предопределил интерес к изучению возможностей индуцирования наилучших для консервации условий взаимодействия клеток со средой, повышения резистентности и пр.

Литературные данные свидетельствуют, что решению этих вопросов в значительной мере может способствовать использование для консервации биологически активных веществ и ряда физических факторов. Клетки периферической крови, отличавшиеся друг от друга не только по морфологическим особенностям, но и по типу обмена, в условиях консервирования обладают различной устойчивостью к физико-химическим воздействиям окружающей среды.

Особое значение приобретает исследование мембран клеток при их консервировании. Именно плазматическая мембрана клетки играет роль биологического барьера, обусловливающего проницаемость для различных веществ и воды. Мембрана ответственна за проникновение в клетку субстратов питания из плазмы и консервирующих растворов и за выделение из клеток продуктов распада, образующихся в процессе обмена веществ. Для этого на клетки воздействуют поверхностно-активными веществами, мембранотропными агентами, взаимодействующими с липидами мембран, антиоксидантами и др.

Серия исследований, проведенных в нашей лаборатории по изучению биологического действия ЭМ на клетки, убедила нас, что разработка консервантов клеток на основе ЭМ перспективна. Такие свойства некоторых ЭМ, как высокая бактерицидная антиоксидантная активность, способность стабилизировать клеточные мембраны, повышать митотическую активность клеток, влиять на репарацию ДНК, на ферментные и обменные процессы клеток, К—Na-ионные каналы, позволили предположить возможность использования ЭМ в качестве консервантов клеток.

Первые серии экспериментов показали с достаточной степенью достоверности (0,05>Р>0,0001), что ЭМ шалфея, кориандра, базилика, непеты, полыни, эвкалипта, бархатцев в количестве 2,5∙10^-5 мг/мл могут повышать число жизнеспособных клеток в культуре на 10— 20% по отношению к контролю. В дальнейшем было выявлено, что аналогичным действием обладают большинство из исследованных масел. Разведение 2,5∙10⁵ —2,5∙10^-8 мг/мл способствовало увеличению числа жизнеспособных клеток. Более низкие концентрации эфирных масел не оказывали влияния на клетки, более высокие (2,5∙10^-1) подавляли рост культур (табл. 22).

Функциональная активность лимфоцитов снижалась и в контрольной, и в опытных группах по мере увеличения срока культивирования. Тем не менее отмечена статистически достоверная разница увеличения количества бластных форм клеток на 7-е сутки культивирования при консервировании их с помощью ЭМ. Следовательно, добавление в среду небольших концентраций ЭМ способствует не только выживаемости клеток, но и сохранению их функциональной активности.

Таблица 22. Жизнеспособность лимфоцитов в культуре с добавлением ЭМ

Контроль	ЭМ полыни	ЭМ шалфея	ЭМ эвкалипта
47,41 Р	57,09 0,1	65,55 0,001	60,05 0,001	63,34 =0,05	68,05 0,001	67,6 0,001	51,1 0,05	51,2 0,1	57,05 =0,05

Примечания.

1. Конечная концентрация указанного вещества — 2,5·10^-6 мг/мл среды.
2. Конечная концентрация указанного вещества — 2,5·10^-7 мг/мл среды.
3. Конечная концентрация указанного вещества — 2,5·10^-8 мг/мл среды.

Композиции интерферон + базилик и интерферон + базилик + витамин Е (также с высокой степенью достоверности) повышали количество жизнеспособных клеток в культуре на 10-е сутки культивирования относительно контроля — 0,05<Р<0,001. В отдельных случаях количество жизнеспособных клеток в 2 раза превышало аналогичный показатель в контроле (табл. 23).

Таблица 23. Влияние ЭМ базилика, интерферона, витамина Е и их смесей на выживаемость лимфоцитов

Контроль	Базилик	Интерферон	Витамин Е	Базилик + интерферон + витамин Е
22,95	33,9 Р<0,001	26,2 Р<0,1	32,3 Р<0,001	45,3 Р<0,001

Далее, изучив более 10 различных ЭМ, мы обратили внимание на ЭМ монарды, которое обладало высоким консервирующим действием. Оно было взято для дальнейших исследований по разработке консервирующего средства.

Изучение предлагаемого консервирующего средства проводили следующим образом.

К 250 мл донорской крови, содержащей стандартный консервант 7б в соотношении 1:4, добавляют 0,25% эмульсию ЭМ монарды в количестве 1—2 мл и перемешивают, 2—3 раза переворачивая флакон. Кровь хранят в холодильнике при 4 °С в течение 2 нед. В аналогичных условиях хранят кровь, содержащую стандартный консервант 76, но без ЭМ монарды (контрольные опыты).

По истечении указанного срока исследуют устойчивость эритроцитов к кислотному гемолизу по методике Стори и Педерцини: консервированную кровь смешивают с равным объемом соляной кислоты. Интенсивность гемолиза эритроцитов учитывают по шкале нефелометра через каждые 30 с при постоянном перемешивании и температуре 24 ˚С.

Результаты проведенных исследований показали, что присутствие в консервированной крови 0,25% водной эмульсии ЭМ монарды способствует уменьшению интенсивности гемолиза наименее стойких эритроцитов и, не повышая гемолиза основной массы эритроцитов, приводит к увеличению времени окончательного гемолиза эритроцитов по сравнению с контрольной группой.

Так, наивысшая интенсивность гемолиза в контрольной пробе наблюдалась на протяжении 3—4 мин. В среднем за 30 с количество эритроцитов в контроле снижалось на 1,06 тыс. клеток в 1 мм.куб. против 0,55 тыс. клеток в 1 мм.куб. в пробе с ЭМ монарды.

В контрольной пробе крови к концу 6-й минуты все эритроциты были гемолизированы, а эритроциты, обработанные ЭМ монарды, лизировались к этому времени лишь на 54,4%; гемолиз эритроцитов с предлагаемым средством заканчивался к 10-й минуте, что в 2 раза превышало аналогичный показатель в контроле.

Сводные данные получены при добавлении 0,25% водной эмульсии ЭМ монарды в кровь, которая перед этим хранилась в течение 2 нед при 4 °С без ЭМ монарды.

Добавление ЭМ монарды способствует уменьшению гемолиза эритроцитов донорской крови при ее хранении в 2 раза.

Для изучения качества консервируемых препаратов крови было проведено сравнение формулы крови до и после хранения в стандартном 7б и предлагаемом консервантах с добавлением эмульсии ЭМ монарды.

В препарате крови, содержащейся в стандартном консерванте, значительно уменьшилось количество сегментоядерных лейкоцитов и увеличилось относительное количество лимфоцитов и моноцитов. Изменений же в формуле крови препаратов, консервированных в растворе 7б с добавлением эмульсии ЭМ монарды, практически не наблюдалось. Таким образом, предлагаемый консервант способствует сохранению исходного клеточного состава консервируемой крови.

Применение ЭМ монарды позволяет расширить ассортимент средств для консервирования крови, сыворотки (плазмы) и эритроцитов, увеличить срок хранения донорской крови в 2 раза, значительно снизить существующие в настоящее время нормы забора крови и связанные с этим финансовые затраты.

Консервация кожи. В экспериментальных исследованиях получены данные о возможности использования РАВ и ЭМ для консервации кожи. Так, животным пересаживали кожу, консервированную при комнатной температуре, используя экстракты чеснока, лука, хрена в течение 1—3—4—7—10 сут. Оказалось, что кожа остается способной к приживлению почти во всех случаях после консервации в течение 3—4 сут, хотя по мере повышения срока консервации способность к приживлению понижается. В отдельных случаях лоскуты кожи приживались и после 10-суточной консервации.

В нашей лаборатории установлено, что средняя продолжительность переживания кожного трансплантата у мышей в зависимости от времени введения эмульсии ЭМ монарды по отношению к операции составляла 11—12 дней, в контроле — 8,7 дня, т.е. длительность переживания кожного трансплантата у мышей при введении им ЭМ монарды была достоверно продолжительнее, чем в контрольной группе, где ЭМ не вводили. Безусловно, что работы в этом направлении следует продолжить.

Для ароматизации воды использовали эфирные масла розы, жасмина, мяты и др., обладающие приятным и своеобразным запахом. ЭМ добавляли в воду в концентрациях 15—30—50—100 мг/л, т.е. в количествах ниже пределов растворения ЭМ в воде. Воду закладывали на хранение. После 3 мес хранения в укупоренной посуде вода сохраняла приятный запах соответствующего вида ЭМ и стерильность при концентрациях 50—100 мг/л. Следует добавить, что ЭМ розы обладает низкой бактерицидной активностью, но высоким дезодорирующим эффектом.

ЭМ очень перспективны для ароматизации санитарно-гигиенической воды. При этом можно получать как конкретные цветочные запахи (гвоздики, жасмина, мяты, магнолии, розы и др.), так и комбинации с запахами леса, сена, морского воздуха. Безвредность ЭМ (в определенных концентрациях) доказана. Более того, АТ подтверждает, что нахождение человека в течение 30—60 мин в атмосфере, содержащей ароматические вещества в дозах 1—2 мг/м.куб., оказывает положительное действие на человека. Такое же действие оказывают массаж с ЭМ, ароматизированные ванны, ароматический воск и т.д. Многие из изученных ЭМ обладают противовоспалительным действием, способствуют регенерации, а при ингаляциях или в ванных способны оказывать седативный или тонизирующий эффект. И если добавление эфирных масел к питьевой воде для консервации весьма проблематично и требует их отделения перед употреблением воды, то введение ЭМ в санитарно-гигиеническую воду следует считать целесообразным и перспективным направлением исследования.

Однако отделение ЭМ от воды легко осуществимо при любых условиях, поскольку 1 г активированного угля сорбирует 20 мг ЭМ.

Нами установлено, что ЭМ можно использовать и для обеззараживания других жидких отходов, отработанной санитарно-гигиенической воды, конденсата атмосферной влаги в гермообъемах.

Консервация урины. Для консервирования влагосодержащих отходов, в частности мочи, употребляют фенолы, детергенты, препараты, содержащие хлор или серную кислоту. Однако все вышеуказанные вещества и способы их применения имеют существенный недостаток, который заключается в их отрицательном действии на организм человека при работе с ними. Кроме того, эти вещества далеко не отвечают тем требованиям, которые перед ними стоят.

На основе ЭМ нами был отработан способ длительного хранения обеззараженной урины за счет исключения ее вторичного бактериального заражения.

При этом обеззараженные жидкие отходы, в частности урины, помещают в контейнеры с пенополивинилформалем, предварительно обработанным 1—3% эмульсией эфирного масла базилика — выдерживанием в эмульсии в течение 1—3 ч. Способ позволяет исключить повторное бактериальное заражение обеззараженных отходов и обеспечивает длительное хранение в течение более 3 мес без изменения концентрации мочевины.

Консервация пищевых продуктов. Нами было также изучено консервирующее действие ЭМ для продления срока хранения прохладительных напитков и их ароматизации. Срок хранения фруктовых напитков по ГОСТу — 2 сут. Этот срок после добавления 5 мг/л ЭМ продлевается до 8 сут, при этом напитки принимают новый ароматический привкус и по сути становятся лечебными. Так, если используют ЭМ розы, напиток оказывает положительное гепатотропное действие; ЭМ жасмина обладает тонизирующим эффектом; ЭМ мяты положительно влияет на сердечно-сосудистую систему. Такие же свойства приобретает и ароматизированный сахар. Следует заметить, что упаковочный материал для ароматизирующего сахара должен быть из фольги или другого материала, не пропускающего летучие вещества.

Мы показали, что добавка ЭМ, например лавра, в растительное масло придает ему не только тонкий дополнительный аромат, но и создает антисклеротический эффект. Для этих целей можно использовать также ЭМ укропа.