Предмет и задачи медицинской микробиологии и ее значение в деятельности врача
ЛЕКЦИИ ДЛЯ СТУДЕНТОВ ЛЕЧЕБНОГО ФАКУЛЬТЕТА (ВЕСЕННИЙ СЕМЕСТР)
Лекция №1
ПРЕДМЕТ И ЗАДАЧИ МЕДИЦИНСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ И ЕЕ ЗНАЧЕНИЕ В ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ВРАЧА
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В МИКРОБИОЛОГИИ
Объектомизучения микробиологии являются микроорганизмы (микробы) - мельчайшие невидимые одноклеточные и многоклеточные существа, которые по многообразию не уступают представителям животного или растительного царства.
Особенности микробов:
- малые размеры (обычно их измеряют в микрометрах, 10-6 м, мкм);
- слабая морфологическая дифференцировка (относительно простое строение);
- быстрый рост и размножение (в благоприятных условиях одна особь за сутки
может дать потомство в сотни миллионов особей);
- высокая активность обменных процессов (быстрый синтез и разложение веществ,
получение энергии);
- повсеместное распространение (связано с выраженной способностью к адаптации).
Микробиология является комплексом наук. В зависимости от объекта исследования различают: бактериологию, вирусологию, микологию (объект - грибы), протозоологию (объект - простейшие). По целям изучения микробиология делится на общую, медицинскую, санитарную, ветеринарную, промышленную, космическую и др.
Задачи медицинской микробиологии:
1. Изучение биологии патогенных (болезнетворных) и нормальных для человека микробов.
2. Изучение роли микробов в возникновении, развитии инфекционных (заразных) болезней и формировании иммунного ответа макроорганизма
("хозяина").
3. Разработка методов микробиологической диагностики (распознавания), специфического лечения и профилактики (предупреждения) инфекционных болезней человека.
Микробиологические исследования проводятся в специальных научных или практических лабораториях, где поддерживается противоэпидемический режим. Соблюдение особых правил работы в лаборатории преследует 2 цели: а) исключить возможность внутри-лабораторного заражения и выноса инфекции за пределы лаборатории; б) предотвратить микробное загрязнение воздуха, оборудования и материалов, снижающее качество анализа.
Лекция №2
МОРФОЛОГИЯ И ФИЗИОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ,
ГРИБОВ, ПРОСТЕЙШИХ.
Световой микроскоп с иммерсионной системой
Для изучения микробов в микроскопе требуется увеличение примерно в 1000 раз. Поэтому используется микроскопы с иммерсионной системой ("иммерсио" – погружение) В состав иммерсионной системы входит иммерсионный объектив (х90) и иммерсионное масло, которым заполняют разрыв между изучаемый предметом и передней линзой иммерсионного объектива. Поскольку показатели преломления стекла и масла близки, это позволяет избежать потери световых лучей вследствие их отклонения, и, тем самым, создать оптимальную освещённость поля зрения. Необходимость в концентрации светового пучка обусловлена также и чрезвычайно малым диаметром передней линзы иммерсионного объектива. При микроскопировании необходимо помнить, что объективы "сухой системы" не предназначены для погружения в масло, которое может привести их в негодность. Микроскопия с иммерсионной системой позволяет изучать убитые микробы в окрашенном состоянии (их форму, размеры, взаимное расположение, строение бактериальной клетки) и дифференцировать одни микробы от других.
Способность микробов окрашиваться различными методами называют тинкториальными свойствами.
В некоторых случаях (изучение морфологии грибов, простейших, других относительно крупных объектов в живом неокрашенном состоянии) используется световой микроскоп с затемнённым полем зрения (объективы х40 или х8) Для микроскопии готовят препараты "раздавленная капля" или "висячая капля".
Измерение микробов.
Изучение морфологических признаков микробов (длина, ширина, форма) нередко проводят для определения их вида. Размеры клеточных микроорганизмов варьируют от долей микрометра (мкм, 10-6м) до нескольких десятков микрометров. Мелкие клетки бактерий имеют размеры 1-2, крупные от 8 до 12 мкм и более. Для измерений используют окуляр-микрометр (встроенную в окуляр прозрачную линейку).
Люминесцентный микроскоп
Принцип работы этого микроскопа основан на явлении люминесценции. Для получения изображения объектов их обрабатывают флюорохромами, которые при возбуждающем облучении коротковолновой частью спектра светятся цветами с большей длиной волны (зеленым, оранжевым и др.). В люминесцентном микроскопе изучают как живые, так и убитые микробы (с "сухой" или иммерсионной системами). Люминесцентная микроскопия позволяет получить контрастное цветное изображение, обнаружить малое количество микробов, изучить их структуру и химический состав, использовать метод иммунофлюоресценции.
Электронный микроскоп
Этот прибор отличается от световых микроскопов значительно большей разрешающей способностью (около 0,001 мкм) за счет использования вместо света пучка электронов, а вместо стеклянных оптических - электромагнитных линз. В электронном микроскопе изучают вирусы, ультраструктуру убитых макроорганизмов.
Лекция №3
Лекция №4
ГЕНЕТИКА БАКТЕРИЙ
Микроорганизмы послужили удобной моделью для генетических исследований, приведших к важнейшим открытиям 20 века в биологии: показано, что материальным носителем (основой) наследственности являются нуклеиновые кислоты - ДНК и РНК; установлено детальное строение хромосомы; расшифрованы механизмы: генетического обмена и его регуляции, достижения генетики микроорганизмов послужили основой для становления и развития новой перспективной отрасли – биотехнологии. Она призвана использовать свойства микробов и клеточных культур, биологических процессов в производстве: биологически-активных веществ (антибиотиков, гормонов, белков, аминокислот ) , энергоносителей, полезных новых видов микробов, сортов растений, видов животных, эффективных вакцин, а также в борьбе с загрязнением окружающей среды и болезнями растений.
Микробы, как объекты генетических исследований, обладают рядом преимуществ: бактерии содержат гаплоидный набор генов, поэтому изменения их генотипа с неизбежностью влекут за собой изменение фенотипа; для них характерно быстрое размножение и огромная численность потомства (быстрая смена поколений); работа с микробами не требует больших затрат.
Лекция №5
ИНФЕКЦИЯ
СЕПСИС
Различают несколько форм взаимодействия /симбиоза/ двух биологических видов, в том числе паразитизм, когда один живёт за счет другого, нанося ему вред / +- /. Паразит, как правило, зависит от хозяина. Частным случаем паразитизма является инфекция.
Инфекция /инфекционный процесс/ - это закономерно развивающийся процесс взаимодействия микроба и восприимчивого макроорганизма, сопровождающийся физиологическими и патологическими реакциями, нарушением гомеостаза и функций организма.
Инфекционная болезнь - крайняя /по выраженности/ форма инфекции.
Лекция №6
ИММУННОЛОГИЯ
ВИДЫ ИММУНИТЕТА
Виды и Формы иммунитета.
Различают, иммунитет тканевой /обусловливает несовместимость тканей/ и антиинфекционный / противомикробный и противопаразитарный /.
Антиинфекционный иммунитет включает: естественную резистентность / неспецифическая защита / и приобретённый иммунитет / специфическая защита /.
Естественная резистентность представлена:
а/ видовой невосприимчивостью /невосприимчивость к микробам, патогенным для других видов/,
б/ невосприимчивостью при генетических отклонениях от нормы /например,
люди с серповидной формой эритроцитов не болеют малярией/,
в/ собственно естественной резистентностью.
Приобретенный иммунитет имеет следующие формы:
I/ активный /в его создании принимает участие собственная иммунная система/, в том числе:
а/ постинфекционный /после перенесённого заболевания/
б/ поствакцинальный /после введения вакцинного препарата/,
2/ пассивный /когда в организм вводятся готовые специфические антитела
или иммуноциты/, в том числе:
а/ плацентарный /передаваемые от матери через плаценту плоду антитела/
б/ постсывороточный /после введения иммунной сыворотки/.
Формы 1а и 2а являются естественным иммунитетом, формы 16 и 26 - искусственным. По направленности приобретенный иммунитет /формы 1а,б и 2а,б/ может быть антитоксическим /защита от чужеродного яда/ и антимикробным /невосприимчивость к микробам/. В свою очередь антимикробный иммунитет /по присутствию или отсутствию в организме живых микробов/ делят на нестерильный /инфекционный/ и стерильный.
Особым видом защиты является местный иммунитет , которому свойственны черты и естественной резистентности и приобретенного иммунитета.
Признаки естественной резистентности:
1. Наследуется, являясь видовым признаком.
2. Отличается относительной стойкостью в течение жизни.
3. Формирование не связано с поступлением антигена /чужеродных агентов/
4. Механизм защиты однотипен вне зависимости от вида возбудителя /неспецифичность защиты/
Признаки приобретённого иммунитета:
1. Приобретается в течение жизни индивидуума /не наследуется/.
2. Нестоек во времени.
3. Строго специфичен /направлен против того возбудителя или яда, к которому иммунизирован индивидуум/.
Лекция №7
АНТИГЕНЫ АНТИТЕЛА
Специфические механизмы защиты /приобретенный иммунитет, иммунный ответ/ предполагают распознавание клетками иммунной системы генетически чужеродных субстанций /антигенов/ и специфическое реагирование на них, которое может проявляться в виде нескольких реакций :
- образование антител /иммуноглобулинов/
- иммунологическая память
- иммунологическая толерантность /специфическая безответность/
- гиперчувствительность немедленного типа /аллергия/
- гиперчувствительность замедленного типа /аллергия/
- идиотип-антиидиотипическое взаимодействие. Эти реакции и в целом иммунный ответ являются функцией иммунной системы.
Иммунная система - это совокупность всех лимфоидных органов и клеток, образующих единый диффузный орган иммунитета. Клетки этого органа постоянно циркулируют с кровотоком по всему телу. Главной клеткой иммунной системы является лимфоцит. Центральные органы иммунитета - тимус /вилочковая железа/ и костный мозг. В них происходит дифференциация, т.е. развитие и "обучение" лимфоцитов, которые становятся, соответственно, Т-лимфоцитами и В-лимфоцитами. Периферические органы иммунитета - селезёнка, лимфоузлы, лимфатические фолликулы /бляшки/, циркулирующие в крови моноциты. В этих органах происходит формирование конкретного иммунного ответа. Иммунный ответ осуществляют иммуно-компетентные клетки /иммуноциты/, т.е. Т-лимфоциты, В-лимфоциты и макрофаги, в ходе их кооперации с участием медиаторов /химических посредников/.
Различают гуморальный иммунный ответ /выработка антител, формирование аллергии немедленного типа/ и клеточный иммунный ответ, связанный с накоплением сенсибилизированных Т-лимфоцитов /гиперчувствительность замедленного типа и др./.
Иммунный ответ контролируют гены I-области 6-й пары хромосом человека. Пусковым механизмом для любой иммунологической реакции является контакт иммунной системы с антигеном.
Антигенаминазывают вещества, которые несут признаки генетической чужеродности и при введении в организм вызывают развитие иммунологических реакций. Если вещество вызывает развитие аллергии, его называют аллергеном. Условия, при которых вещество может быть антигеном:
I/ чужеродность /по отношению к иммунной системе конкретного организма/
2/ достаточно большая молекулярная масса /более 10 килодальтон/
3/ достаточно сложная структура
4/ жесткое расположение детерминантных групп в молекуле
5/ хорошая растворимость во внутренней среде организма.
Антигенами являются: белки различного происхождения, сложные полисахариды, липополисахариды, комплексы белков с липидами или нуклеиновыми кислотами. Не являются антигенами: простые неорганические и органические соединения, липиды, чистые препараты нуклеиновых кислот. Для полноценных антигенов характерны следующие свойства: чужеродность, антигенность, иммуногенность и специфичность. Чужеродность - признак /"печать"/ работы чужого генома /организма/. Он появляется при высокой уровне организации биомолекул /например, отсутствует у аминокислот или пептидов, но появляется у сложных белков/. "Чужеродность относительна /кроличий белок альбумин не чужероден для кролика, но чужероден для мыши или морской свинки/. Антигенность - способность вызывать иммунологические реакции большей или меньшей степени выраженности /например, глобулин обладает большей антигенностью, чем альбумин, т.к. после введения глобулина образуется больше антител/. Иммуногенность - способность вызывать формирование иммунитета /невосприимчивости к микробам или токсинам/. Например, антигены возбудителя брюшного тифа или кори более иммуногенны, чем антигены возбудителя дизентерии, после которой нет стойкого иммунитета и бывают повторные заболевания. Специфичность - это то, чем антигены отличаются друг от друга. Она определяется их химической структурой. Наиболее значимые для специфичности химические группы /антигенные детерминанты/: обладают гидрофильностью, концентрируют определенный заряд и ориентированы наружу. Количество антигенных детерминант /валентностей/, присоединяющих I молекулу антитела, у разных антигенов колеблется от 10 до 1000 и более.
По специфичности различают следующие типы антигенов:
I/ видовой антиген, определяется у всех представителей данного вида и отсутствует у представителей других видов /у микробов, животных, человека его можно выявить в реакции с видоспецифическими иммунными
сыворотками/,
2/ типовой антиген, обусловливает различие среди особей одного вида; например, возбудитель дизентерии Флекснера имеет 6 антигенных вариантов - сероваров. У человека различают более 70 изоантигенов, обусловливающих различия по группам крови, резус-фактору, антигенам тканевой совместимости. Несовпадение по изоантигенам донора и реципиента может быть причиной реакции отторжения пересаженной ткани или органа,
3/ гетерогенный антиген, является общим для представителей разных видов; так, у возбудителя чумы и других микробов есть общие антигены с тканями человека /антигенная мимкрия/; общие антигены могут быть у представителей разных видов микробов, входящих в одно семейство, или весьма отделённых /групповые антигены/,
4/ аутоантигены - это вещества, способные иммунизировать тот организм
из которого они получены. Нормальными аутоантигенами являются ткани
организма, которые в норме не соприкасаются с иммунной системой
/мозг, хрусталик глаза, семенники/; они в случае травмы могут иммунизировать организм. Патологическими аутоантигенами могут быть патологически измененные ткани после обморожения, ожога, облучения, действия микробных токсинов.
Все антигены можно разделить на полноценные, обладающие всеми свойствами антигена, и неполноценные /гаптены/. Гаптенами называют вещества, не способные при введении в организм вызывать иммунологические реакции, но вступающие в специфические реакции с готовыми антителами или иммуноцитами. Гаптены становятся полноценными антигенами после укрупнения молекулы /соединения с белком, полисахаридом или другим носителем/. Гаптенами могут быть: несложные полипептиды, липидн, нуклеиновые кислоты, простые органические вещества, антибиотики, формальдегид и др. Простые гаптены при взаимодействии с соответствующими антителами не дают видимой реакции осаждения /преципитации/, а сложные гаптены - дают /выпадает осадок/. Проникая в организм, гаптены могут соединяться с его белками /свободными или в составе клеток/ и становиться полноценными антигенами, иммунизируя организм. Это может приводить к патологическим состояниям /контактные дерматиты у рабочих на производстве антибиотиков или витаминов, аллергические реакции после введения лекарств; если гаптен имеет сродство к клеткам крови, может развиться анемия, лейкопения или пурпура/.
Микробные антигены. К ним относят: целые микробные клетки /убитые и живые/, токсины, продукты распада клеток, извлекаемые из клеток фракции. В антигенной структуре микробной клетки различают: Н-антиген /белковый антиген жгутиков/, К-антиген /поверхностный белковый или полисахаридный антиген оболочки/, О-антиген /липополисахарид клеточной стенки, соматический антиген/, цитоплазматические антигены. Протективным антигеном микроба называют антиген с наибольшей антигенностью и иммуногенностью, который при введении способствует формированию стойкого иммунитета. Поэтому протективные антигены вводят в состав вакцин. Цели изучения микробных антигенов:
- определение вида и варианта /идентификация/ возбудителя по антигенной структуре,
- быстрая индикация /обнаружение/ микробов в исследуемом материале иммунологическими методами /при помощи иммуноглобулиновых препаратов
- конструирование антигенных препаратов /диагностикумов, аллергенов/ для диагностики инфекционных заболеваний по иммунному ответу организма /серодиагностика - обнаружение антител, аллергодиагностика - обнаружение сенсибилизированных лимфоцитов,
- создание вакцин и сывороток для профилактики и лечения инфекций.
Препараты микробных антигенов можно получить из культуральной жидкости /секретируемые/ или путем разного рода воздействий на клетки /нагреванием - 0-антиген, обработкой формалином - Н-антиген; используют также ультразвуковую дезинтеграцию, фракционирование, химическую экстракцию и т.д./. Антигены можно создать в лабораторных условиях путём химического синтеза /синтетические антигены/.
Антитела- это белки животного происхождения, образуемые лимфоидными органами позвоночных при внедрении антигенов и способные вступать с ними в специфическое взаимодействие. Они отличаются особым строением и свойствами, входят в состав гамма-глобулиновой фракции сыворотки крови и поэтому их называют иммуноглобулинами.
Свойства антител: специфичность и ряд физико-химических особенностей Специфичность - способность вступать в реакцию только с тем антигеном, который вызвал их образование.
Физико-химические свойства; а/ относительная термостабильность, б/ относительная устойчивость к действию протеаз, в/ устойчивость к денатурации этанолом при 0-4°С, г/ осаждаются без денатурации нейтральными солями /сульфатом аммония и др./. Эти свойства используются при получении иммуноглобулиновых препаратов.
Различают 5 классов иммуноглобулинов (Ig ), отличающихся по массе /150 - 900 КД/, физико-химическим свойствам, строению и функциональным особенностям: G , М, А, Е, Д. Основную массу сывороточных иммуноглобулинов составляют антитела трёх классов: IgG /70-80%/, IgA /10-15%/ и IgM /5-10%/; остальные / IgE и IgD / - 0,2 %.
Строение иммуногдобулина /IgG , мономер/. IgG состоит из 4 полипептидных цепей, соединенных дисульфидными связями: пары идентичных тяжёлых /50 КД/ и пары идентичных лёгких /23 КД/ цепей с шарнирным участком в середине молекулы. При обработке протеолитическим ферментом папаином IgG распадается на 3 фрагмента: 2 идентичных с активными центрами /антидетерминантными группами/ - Fаb1 и Fаb2 , способных вступать в реакцию с антигеном, и фрагмент Fс /кристаллизующийся, константный/, не вступающий в связь с антигеном. Свободные концы /активные центры/ обоих Fab фрагментов составлены из вариабельных участков - тяжелой и легкой цепи. Конфигурация активного центра повторяет пространственную структуру антигенной детерминанты в виде полости /как перчатка повторяет форму руки/. Остальные участки молекулы константны т.е. имеют одинаковые аминокислотные последовательности у антител разной специфичности. Этими участками /Fс/ антитела могут адсорбироваться, например, на специальных рецепторах иммуноцитов.
IgG двухвалентны – имеют 2 активных центра, IgM пятивалентны – имеют 5 активных центров/ пентамер /.
Краткая характеристика классов иммуноглобулинов.
IgC - сывороточные антитела /150 КД/ , в большом количестве образуются при повторном поступлении антигена, проходят через плаценту, высокоспецифичны, нейтрализуют микробные частицы и токсины, взаимодействуют с гаптенами.
IgM - сывороточные антитела /900 КД/, появляющиеся в 1-е дни после 1-го контакта с антигеном, менее специфичны, чем IgG , не проходят через плаценту, но могут быть в секретах на слизистых оболочках, активно связывают комплемент, участвуют в лизисе клеток.
IgA - содержатся в сыворотке крови /мономер, 170 КД/ и в секретах /молоке, на "слизистых оболочках - димер, 430 КД/. При прохождении /из кровеносного русла/ через эпителий они приобретают "секреторный компонент", который предохраняет молекулу от разрушения ферментами секретов. IgA имеет большое значение в создании местного иммунитета, препятствуя адгезии микробов к эпителиоцитам и колонизации ими слизистых оболочек.
IgE - сывороточные термолабильные антитела-реагины /190 КД/; обладают цитофильностью /фиксируются на клетках/, способствуя развитию аллергических реакций немедленного типа; не проходят через плаценту; усиливают проницаемость сосудов.
IgD - сывороточные термолабильные антитела /180 КД/, функции которых
уточняются.
Различают полные и неполные антитела. Полные антитела имеют 2 или более валентности и образуют с антигеном комплексные соединения /сетевые структуры/. Так как I молекула антитела может связываться с 2 и более антигенами, то приводит к изменению физико-химического состояния антигена и видимым феноменам - агглютинации /образуются хлопья/, преципитации /выпадает осадок/ и др. Неполные антитела /блокирущие/ моновалентны, т.к. имеют I активный центр. Они не дают сетевых структур и не, обнаруживаются в прямых реакциях иммунитета /их обнаруживают непрямыми методами - путём нейтрализации антигена или в антиглобулиновом тесте Кумбса/.
Динамика накопления антител различна в зависимости от того, первично или вторично поступает данный антиген в организм. При первичном иммунном ответе антитела могут быть обнаружены в крови через 3-4 дня после контакта с антигеном. Это латентная /индуктивная/ фаза иммуногенеза - период скрытого антигенного раздражения и кооперативного взаимодействия иммуноцитов, в результате чего из В-лимфоцитов образуются и накапливаются плазматические клетки, продуцирующие антитела /продуктивная фаза иммуногенеза/. Максимальное количество антител отмечается на 7-20 день; после этого наблюдается снижение титра до минимума, который наступает через 2-3 месяца. С начала продуктивной фазы (Образуются IgM , затем дополнительно продуцируются IgG и IgA, Вторичный иммунный ответ имеет следующие отличия: а/ укороченный латентный период, б/ более быстрый подъём концентрации антител,
в/ более высокие значения максимальных титров /в 3 и более раз/
г/ вырабатываемые антитела относятся к IgG . Способность к такому усиленному ответу сохраняется до нескольких лет и является одним из проявлений иммунологической памяти, которая поддерживается в организме за счет сенсибилизированных Т-лимфоцитов. Эти закономерности иммуногенеза лежат в основе современных методов вакцинации /ревакцинации/.
Реакции иммунитета
Реакциями иммунитета /серологическими реакциями/ называют действие между антигенами и антителами, ведущее к образованию иммунного комплекса /антиген-антитело/. Они протекают, как правило, в 2 фазы в присутствии дополнительного фактора /электролит, комплемент, фагоцит или др./Специфическая фаза /невидимая: "химическая"/ происходит очень быстро и характеризуется соединением детерминантной группы антигена с активным центром антитела. В результате образуется комплекс, утрачивающий растворимость в изотонических растворах /например, в растворе хлорида натрия, ИХН/. Неспецифическая фаза /видимая, "коллоидная"/ наступает через несколько минут или часов и характеризуется укрупнением комплекса антиген+антитело с изменением его физических свойств. Эта фаза сопровождается видимыми феноменами: выпадением осадка, образованием хлопьев, просветлением взвеси, остановкой движения частиц и др.
Реакции иммунитета высокоспецифичны и их широко применяют на практике
для серодиагностики инфекций /по обнаружению антимикробных антител в сыворотке крови/, определения вида и варианта микроба по антигенной структуре, определения других антигенов / аллергенов, гормонов, биологических образцов разного происхождения /. Области применения peaкций иммунитета: диагностика инфекционных и неинфекционных заболеваний, фармация, санитарно-ветеринарная служба, трансплантация органов и тканей /в т.ч. крови/, судебная медицина.
Реакция агглютинации /РА/ - это взаимодействие корпускулярного антигена /взвеси бактерий, других "клеток или частиц/ и антител-агглютинов в изотоническом растворе с образованием и осаждением агглютината /хлопьев из склеившихся частиц/. Eе ставят несколькими методами. Быстрая ориентировочная РА ставится на предметном стекле и учитывается в течение 2-3 мин после смешивания ингредиентов и покачивания стекла. Более надежные результаты даёт использование адсорбированных и монорецепторных сывороток, что позволяет избежать неспецифических реакций, например, с родственными бактериями за счет общих антигенов. Развёрнутая /объёмная/ РА более точна, она ставится в пробирках и учитывается через сутки. В ряду пробирок готовят последовательные двукратные разведения сыворотки в ИХН - 1:50, 1:100, 1:200, 1:400 и т.д. Затем в каждую пробирку добавляют одинаковое количество взвеси клеток, встряхивают и ставят при комнатной температуре. Результат учитывают по характеру осадка и просветлению надосадочной жидкости. Титром агглютинирующей сыворотки считают её максимальное разведение, при котором наблюдается выраженная реакция. РА используют для идентификации микробов по антигенной структуре, для определения антимикробных антител и их титра в сыворотке при серодиагностике инфекционных заболеваний, при определении группы крови и т.п.
Реакция пассивной /непрямой/ гемагглютинании /РПГА/ является разновидностью непрямых агглютинационных реакций, наряду с реакцией коагглютинации, агглютинации латекса и др. Эти реакции более чувствительны, чем РА, т.к. предварительно стандартный антиген /или антитело/ присоединяют к корпускулярному носителю - эритроцитам, убитым микробам или частицам латекса, получая, соответственно, эритроцитарные, коагглютинирующие или латексные диагностикумы /антигенные или иммуноглобулиновые/. РПГА с антигенным эритроцитарным диагностикумом ставят в пробирках или лунках планшета с двукратными разведёниями сыворотки /например, с целью серодиагностики инфекций или выявления напряжённости иммунитета - по титру антител/. При положительной реакции через 4-20 ч формируется рыхлый осадок эритроцитов на всей площади дна пробирки или лунки При отрицательной реакции эритроциты образуют плотный осадок в центре /в виде пуговицы/. РПГА с иммуноглобулиновыми диагностикумами учитывают так же, но её ставят для быстрой индикаций возбудителя в исследуемом материале или его идентификации по антигенной структуре. Это метод экспресс-диагностики.
Реакция преципитации /РП/- это выпадение в осадок растворимого антигена при взаимодействии с соответствующими антителами-преципитинами в присутствии электролита. Антигеном может быть прозрачный раствор белка или гаптена, различные экстракты. РП ставят несколькими методами. Метод кольцепреципитации: на диагностическую сыворотку с известными преципитинами в узкой пробирке сверху осторожно наслаивают раствор антигена и в течение часа учитывают положительную реакцию /на границе жидкостей образуется белый диск преципитата и постепенно оседает/. Так определяют, например, антиген возбудителя сибирской язвы в разных материалах. Метод преципитации в капилляре: стеклянный капилляр диаметром I мм сначала опускают на 1/3 в диагностическую сыворотку, а затем на 1/3 - в раствор антигена, переворачивают несколько раз и оставляют в вертикальном положении на сутки. Зёрна преципитата оседают и собираются столбиками на нижнем мениске жидкости в капилляре. Так определяют, например, С-реактивный белок /СРБ/ при аутоиммунных заболеваниях, ревматизме, туберкулёзе, инфаркте миокарда /диагностическую сыворотку с преципитинами к СРВ получают путем иммунизации кроликов/. Методы диффузной преципитации в агаровом геле; растворы антигенов и антител помещают в разные места прозрачного геля, из которых они диффундируют, образуя при встрече преципитат в виде белых полос или линий. В методе простой диффузии антиген диффундирует в агаре, содержащем определенную концентрацию диагностической сыворотки, которую предварительно вводили в не застывший агар В методе двойной диффузии антигены и антитела из лунок в агаре диффундируют навстречу друг другу в нейтральном слое агара.
В методе иммуноэлектрофореза раствор неоднородного антигена сначала подвергают фракционированию в агаровом геле под действием постоянного тока а затем канавку в геле, сделанную сбоку от линии распределения фракций заполняют сывороткой /антителами/. В результате двойной диффузии в геле образуется специфический рисунок из дуг к линий преципитата, вид которого зависит от количества и качества фракций антигена и антител.
РП обладает высокой чувствительностью, она позволяет выявлять белковые антигены в разведениях 1:100000 и выше, т.е. недоступных для обнаружения химическим путём. Титром преципитирующей сыворотки считают наибольшее разведение антигена, дающее преципитацию при контакте с ней. Такая особенность связана с мелкодисперсным состоянием антигена, малыми размерами его молекул. РП применяют для индикации микробных антигенов в материале от больных и из внешней среды, определения иммуноглобулинов разных классов /диагностика и профилактика инфекций и иммунодефицитов/ для выявления фальсификации пищевых продуктов /санитарная практика/, для определения видовой принадлежности крови и других биологических примесей /судебно-медицинская практика/.
Реакция нейтрализации токсина антитоксином /РН/ - серологическая реакция между микробным экзотоксином и антителами, приводящая к инактивации ядовитого действия токсина. Её ставят в опытах на животных: для обнаружения экзотоксина в исследуемом материале; для определения титра антитоксина в иммунной сыворотке. Например, материал, содержащий экзотоксин, смешивают с известной диагностической сывороткой /в избытке/, выдерживают 30 мин и вводят животным. Если сыворотка нейтрализует токсин, отравления и гибели животных нет. Если токсин не соответствует антитоксинам сыворотки, животные погибают /как и в контрольной группе животных, получивших тот же материал без сыворотки/. Для определения антитоксической сыворотки ставят такой же опыт, но берут стандартный экзотоксин известной, силы и смешивают с сывороткой в разных соотношениях. Определяют наименьшее количество сыворотки, нейтрализующее определенное число минимальных летальных доз-ДЛМ токсина /это количество соответствует I антитоксической единице, АЕ сыворотки/. Титр сыворотки выражают количеством АЕ или ME /международных антитоксических единиц/ в I мл сыворотки. Например, I ME противодифтерийной сыворотки нейтрализует 100 ДЛМ дифтерийного токсина для морской свинки.
Титрование антитоксических сывороток проводят и в пробирках - в реакции флоккуляции /разновидность РП/. Оно основано на том, что при смешивании экзотоксина или анатоксина /т.е. белкового антигена/ с титруемой сывороткой наиболее раннее помутнение /инициальная флоккуляция/ наблюдается в пробирке с эквивалентным соотношением токсина /анатоксина/ и антитоксина / т.е. I TE(Lf) : I AE(ME) /.
Реакция иммунофлюоресценции /ИФ/ - взаимодействие люминесцирующих антител с корпускулярным антигеном и образование светящегося иммунного комплекса. Метод основан на способности иммуноглобулинов прочно соединяться с флюорохромами /ФИТЦ, акридиновым оранжевым и др./ без потери специфичности. Под действием ультрафиолета флюорохромы дают вторичную люминесценцию. В прямом методе ИФ на предметном стекле готовят и фиксируют мазок из антигенсодержащего материала, наносят на него люминесцирующую сыворотку /например, противочумные антитела, меченные ФИТЦ/. После 30-минутного контакта препарат тщательно промывают и изучают под люминесцентным микроскопом. Клетки чумного микроба в исследуемом материале светятся по периферии желто-зеленым цветом. ИФ протекает в I фазу и обладает рядом достоинств: высокочувствительна, проста в постановке, может использоваться как метод экспресс-диагностики /ответ в течение 1-2 ч/. Её используют для быстрого обнаружения микробов в исследуемом материале а также для их идентификации.
Иммуноферментный анализ /ИФА/. Основан на использовании антител, меченных ферментом, который проявляет в присутствии субстрата специфическую активность в случае образования комплекса антиген+антитело, фиксированного на твёрдой основе. ИША широко используют для определения разнообразных антигенов и антител. Разработано много методов и модификаций ИФА, выпускаются коммерческие наборы. Для определения антигена в исследуемом материале /сэндвич-метод/ вначале производят сорбцию известных антител на поверхности лунок полистироловой пластины, затем вносят антигенсодержащий материал, и, после контакта, тщательно промывают. Затем в лунки добавляют соответствующие антитела /сыворотку/, меченные пероксидазой хрена или другим ферментом, отмывают и добавляют хромогенный субстрат / 5-аминосалициловую кислоту с перекисью водорода или др./
При положительной реакции в течение I часа развивается коричневое окрашивание, интенсивность которого зависит от количества меченных антител, связанных в иммунном комплексе. Для определения неизвестных антител /например, с целью серодиагностики сифилиса или ВИЧ-инфекции/ на поверхности лунок сорбируют известный антиген, затем добавляют исследуемую сыворотку крови, промывают, вносят сыворотку с антителами против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом, и, после вторичной промывки, добавляет хромогенный субстрат. Учитывают так же ИФА отличается высокой чувствительностью и специфичностью. /
* Непрямой метод ИФ отличается тем, что на стекло наносят обычные кроличьи антитела, которые образуют с клетками невидимый комплекс АГ+АТ. Затем препарат промывают и обрабатывают люминесцирующей: сывороткой с ослиными /лошадиными/ AT к кроличьему белку /образуется двойной светящийся комплекс/. Этот метод более экономичен, т.к. используется одна люминесцирующая и набор нелюминесцирующих сывороток.
ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКОТОРЫХ РЕАКЦИЙ ИММУНИТЕТА /РИ/
| РИ | Направление исследования | Ингредиенты | Феномен/уче-ный признак/ | ||
| Антиген | Антитело | Дополн. ф-р | |||
| РА | 1.Серодиагностика 2.Идентификация клеток | Корпускулярный диагностикум /взвесь клеток/ Взвесь микробных или др. клеток /Х/ | Агглютинины сыворотки крови больного /Х/2 Агглютинины диагностич. сыворотки | ИХН Тот же | Образование хлопьев /агглютината/ Тот же |
| РПГА | 1.Серодиагностика 2.Индикация антигена | Эритроцитарный /антигенный диагностикум Корпускулярный или растворимый | Агглютинины сыворотки крови больного /Х/ Эритроцитар-ный иммуно-глобулиновый диагностикум |