Хроматографическое исследование

Для идентификации и разделения флавоноидов используют методы бумажной, колоночной хроматографии и хроматографии в тонком слое сорбента.

Используют различные системы растворителей:

· для БХ чаще всего БУВ (бутанол – кислота уксусная - вода) 4:1:5; 4:1:2;

· для ТСХ - хлороформ-метанол 8:3; 8:2.

Идентифицируют флавоноиды по характерному свечению на хроматограммах в УФ-свете до и после проявления хромогенными реактивами.

Катехины и лейкоантоцианидины не флуоресцируют. Гликозиды флавонов и изофлавонов флуоресцируют голубым или синим цветом, флавонолов - темно-коричневым или черным, агликоны флавонов - коричневым, флавонолов - желтым, халконы и ауроны имеют желтую или оранжевую флуоресценцию.

Для проявления флавоноидов на хроматограммах используют:

1) пары аммиака 25 %. Происходит усиление окраски пятен в УФ-свете или изменение окраски на желтую.

2) 2-5 % спиртовой раствор алюминия хлорида. Наблюдается желто-зеленая флуоресценция в УФ-свете, в видимом свете - желтое окрашивание пятен.

3) Катехины проявляют 1 % раствором ванилина в кислоте концентрированной хлористоводородной, в видимом свете наблюдается красное окрашивание.

Реже используют реактив Вильсона, 2 % метанольный раствор хлорокиси циркония, раствор сурьмы пятихлористой в хлороформе, диазореактив.

В ГФ ХI приводится исследование методом бумажной хроматографии халконов и ауронов в траве череды, изофлавонов в корнях стальника; хроматографии в тонком слое сорбента на пластинке «Силуфол» - флавоноидов в цветках и плодах боярышника, флавон-5-гликозидов в траве хвоща полевого.

Количественное определение

Для количественного определения флавоноидов в лекарственном растительном сырье используют физико-химические методы анализа (преимущественно фотоэлектроколориметрические и спектрофотометрические методы).

Фотоэлектроколориметрический (ФЭК) метод.

ФЭК-метод основан на измерении оптической плотности окрашенных растворов, полученных по реакции флавоноидов с солями металлов или азосочетания с солями диазония.

ГФ ХI приводит ФЭК-метод для определения содержания суммы флавоноидов в листьях вахты трехлистной. Предварительно сырье очищают от хлорофилла хлороформом, получают спиртовое извлечение флавоноидов, затем проводят реакцию образования азокрасителя с диазотированным стрептоцидом и измеряют оптическую плотность окрашенного раствора с помощью ФЭК. Содержание суммы флавоноидов расчитывают по калибровочному графику, построенному по стандартному образцу рутина.

Спектрофотометрический метод (СФМ).

СФМ основан на способности флавоноидов или их окрашенных комплексов поглощать монохроматический свет при определенной длине волны.

1. Получают спиртовое извлечение и измеряют собственное поглощение:

· в цветках бессмертника песчаного при длине волны 315 нм, рассчитывают содержание флавоноидов в пересчете на изосалипурпозид с использованием оптической плотности ГСО изосалипурпозида;

· в корнях стальника при длине волны 260 нм, рассчитывают в пересчете на ононин с учетом оптической плотности ГСО ононина;

· в цветках пижмы измеряют оптическую плотность флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в буферном растворе и пересчитывают на лютеолин с учетом оптической плотности ГСО лютеолина.

2. Получают спиртовое извлечение, затем проводят реакцию образования комплекса с 2 % спиртовым раствором алюминия хлорида и измеряют оптическую плотность:

· в траве зверобоя в пересчете на рутин с учетом оптической плотности ГСО рутина;

· в траве горца перечного в пересчете на кверцетин с учетом удельного показателя поглощения комплекса кверцетина с алюминия хлоридом;

· в траве спорыша (горца) птичьего в пересчете на авикулярин с учетом удельного показателя поглощения комплекса авикулярина с алюминия хлоридом.

3. Получают извлечение антоцианов 1 % раствором кислоты хлористоводородной из цветков василька синего, при этом образуются окрашенные оксониевые соли, у которых измеряют оптическую плотность и пересчитывают на 3,5-дигликозид цианидина (цианин) с учетом удельного показателя поглощения цианина в 1 % растворе кислоты хлористоводородной.