Медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина

ОСНОВЫ ПРОИЗВОДСТВА ГИПЕРИММУННЫХ СЫВОРОТОК И ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

Учебно-методическое пособие по биотехнологии

Москва 2003

Удк 619:615.371(075)

Т.Н. Грязнева, И.В. Тихонов, Д.А. Девришов

Основы производства гипериммунных сывороток и иммунноглобулинов /Учебно-методическое пособие по биотехнологии.— М.: МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, 2003. — 48 с.

Изложены методы получения гипериммунных сывороток и иммунноглобулинов, применяющихся для профилактики инфекционных болезней и лечения больных животных.

Предназначено для студентов ветеринарных, ветеринарно-биологических и зооинженерных факультетов высших учебных заведений, а также для практикующих ветеринарных врачей.

Рецензенты:

М.Н. Левчук -профессор кафедры биотехнологии Военного университета радиационной, химической и биологической защиты МО РФ, доктор медицинских наук.

Ю.Д. Караваев– заведующий отделом эпизоотологии, диагностики и профилактики болезней овец и других животных ВИЭВ, доктор ветеринарных наук.

Г.В. Павлов - профессор кафедры микробиологии и иммунологии МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, доктор биологических наук.

Утверждены учебно-методическим объединением высших учебных заведений РФ по образованию в области ветеринарии и зоотехнии (протокол № от 2003 г.)

Основы производства гипериммунных сывороток

И иммунноглобулинов

1. Цель занятия: Изучить технологию изготовления гипериммунных сывороток и иммунноглобулинов.

2. Место проведения занятия: учебная лаборатория.

3. Длительность занятия: 4 академических часа.

4. Материальное обеспечение:

4.1. Сыворотки и гамма-глобулины фабричного производства.

4.2. Нативная сыворотка крови животных.

4.3. Риванол (этакридина лактат) в порошке и в виде 3 %-ного раствора.

4.4. Химически чистая соль (NaCI).

4.5. Флаконы емкостью 10 и 100 мл.

4.6. Пробкозакатывающая машина.

4.7. Обеззоленные бумажные фильтры.

4.8. Лабораторная посуда (колбы, мерные стаканы, воронки).

5. Распределение рабочего времени (180 минут):

5.1. Организационные вопросы - 10 мин.

5.2. Теоретическая часть - 40 мин.

5.3. Практическая часть - 120 мин.

5.4. Уборка рабочего места - 10 мин.

Таблица 1

План

Проведения лабораторной работы

№	Содержание занятия	Основная литература
1. 2. 3. 4. 5.	Основы производства гипериммунных сывороток. Методы получения гамма-глобулинов. Риваноловый метод получения гамма-глобулина. Контроль качества готового препарата. Фасовка готового препарата.	1. Балашенко С.Г., Урбан В.П. Иммунные глобулины в ветеринарии. Минск, «Урожай», 1972. 2. Кленина Н.В. Гамма-глобулины в ветеринарии. М.: Урожай, 1971. 3. Сафонов А.Ф., Пирожков Г.В. Получение и применение неспецифического гамма-глобулина / Сб. науч.тр. КНИВИ, 1992. 4. Синицин В.А. и др. Фракциони- рование белков плазмы крови с целью препаративного получения гамма-глобулинов и альбумина. Харьков УААН, ИЭКВМ, 1995. 5. Тутов И.К., Ситьков В.И. Основы биотехнологии ветеринарных препаратов. Ставрополь, 1997.

Практическая работа

1. Получить гамма-глобулин из сыворотки крови животных риваноловым методом.

2. Провести контроль качества готового препарата.

3. Расфасовать и закатать полученный гамма-глобулин во флаконы.

Теоретическое содержание занятия

Основы биотехнологии производства

Гипериммунных сывороток

Важнейшей задачей прикладной иммунологии является разработка методов и средств сывороточной профилактики и серотерапии при инфекционных болезнях животных.

Гиперимунныеили специфические сыворотки представляют собой сыворотки крови животных, систематически иммунизированных бактериальными или вирусными антигенами.

Гипериммунные сыворотки содержат антитела, обладающие строго специфическим действием на бактериальные токсины, патогенные бактерии или вирусы, против которых иммунизировали животных.

Таблица 2

Отбор животных-продуцентов. Грундиммунизация

Получение гипериммунных сывороток осуществляется в несколько этапов:

1. Подбор животных - продуцентов

2. Грундиммунизация (грундирование) - отбор животных из числа завезенных путем создания у них основы иммунитета.

3. Гипериммунизация животных-продуцентов

4. Приготовление сывороточных препаратов

Подбор животных-продуцентов

Всех завезенных на биофабрику животных выдерживают в карантине 45 суток. За это время их всесторонне обследуют с ежедневным (утром и вечером) двукратным измерением температуры тела, проверяют на пораженность гельминтами и при необходимости дегельминтизируют.

Всех животных исследуют на инфекционные болезни, согласно требованиям нормативно-технической документации.

Лошадей исследуют:

1. Caп

2. Трихомоноз

3. Бруцеллез

4. Туберкулез

5. Пироплазмидозы

6. Инфекционная анемия

Крупный рогатый скотисследуют:

1. Туберкулез

2. Бруцеллез

3. Лептоспироз

Свиней исследуют:

1. Туберкулез

2. Бруцеллез

Овец исследуют:

1. Бруцеллез

2. Туберкулез

3. Паратуберкулез и др.

При отборе животных-продуцентов учитывают их физиологические и иммуннобиологические показатели.

На активность выработки животным-продуцентом гипериммунной сыворотки антител влияют:

1. Тип нервной деятельности животного-продуцента

2. Реактивность организма

3. Порода

4. Пол

5. Конституция

6. Возраст

Лошадей используют в возрасте от 3 до 12 лет, помеси донской и казахской пород, массой 450-500 кг.

Волов используют в возрасте от 3 до 8 лет, массой не менее 350 кг, красностепной, калмыцкой, симментальской, швицкой астраханской пород.

Свиней используют в возрасте 5-6 месяцев, массой не менее 80 кг, крупной белой породы.

Овец, баранов и валухов используют в возрасте 2-3 лет и массой 30-45 кг (для получения диагностических сывороток и сывороточных сред).

Учитывая, что введение антигенов животным и периодическое кровопускание приводят к нарушению обмена веществ и анемии, а в ряде случаев, и к снижению титров антител, главное внимание уделяют вопросам полноценного, сбалансированного кормления животных-продуцентов.

Кормление животных-доноров отличается от кормления других животных и осуществляется по специально разработанным и утвержденным рационам.

Такие рационы должны содержать по 11-12 кормовых единиц и по 1000-1200 г переваримого протеина, а также включать сочно-витаминные корма и быть строго сбалансированными по минеральному составу.

Для восстановления крови после крововзятия важно правильно организовать минеральное кормление животных.

На 1 кг сухого корма лошадей должно приходиться:

железа - 145-165 мг;

меди - 15-18 мг;

кобальта -1,2-1,4 мг;

марганца - 9 мг.

Для восстановления красной крови лошадям вводят в рацион эритроциты, фибрин, кормовые антибиотики, проращенный овес. Иногда проводят реинфузию эритроцитов.

Кормят животных-продуцентов 3-5 раз в день, водопой - вволю, соль лизунец - вволю (кроме свиней).

Крупных животных содержат индивидуально, мелкий рогатый скот и свиней - группами.

Гипериммунизация животных

Гипериммунизация - это метод парэнтерального введения животным нарастающих доз соответствующих антигенов с целью получения наивысшей ответной имунологической реакции организма, а следовательно, и максимального увеличения в крови животных титра специфических антител, который должен обеспечить лечебный, профилактический и диагностический эффект препаратов.

При гипериммунизации сыворотка крови меняется. Обычно нарастает количество общего белка, увеличивается количество гамма- и бета- глобулиновых фракций, уменьшается содержание альбуминов.

Так, если в нормальной сыворотке крови лошадей альбумины составляют 50 % от общего количеств белков, то в иммунной сыворотке их бывает 35 % и ниже.

Успех гипериммунизации животных-продуцентов во многом зависит не только от тщательного их подбора, качества антигена и адьювантных веществ, но и от правильно выбранной схемы гипериммунизации, правильной технологии выполнения этих схем иммунизации, а также технологии кровопускания или обескровливания продуцентов в конце их эксплуатации.

Антиген вводится обычно подкожно или внутримышечно в несколько мест с таким расчетом, чтобы точки инъекции находились вблизи лимфатических узлов. При этом, в иммуногенез быстрее вовлекается большое количество лимфоузлов, что повышает общую и иммунологическую реактивность организма. Введение антигена одновременно в несколько мест, кроме того, обеспечивает лучшую рассасываемость его и появление более равномерных и менее болезненных инфильтратов.

Антигены в небольших дозах (5-25 мл) обычно вводят подкожно в верхнюю часть шеи животного, а в больших количествах - в область спины и крупа внутримышечно.

Нужно иметь в виду, что при введении животному больших доз антигена образуются инфильтраты и даже абсцессы. Но абсцессы обычно бывают стерильными.

Места введения антигена или крововзятия протирают дезинфицирующими растворами.

Для гипериммунизации, как было показано выше, чаще всего использую лошадей. Цикл гипериммунизации обычно длительный и составляет 1-2 и более месяцев. Впрочем, в каждом случае цикл иммунизации во многом зависит от вида получаемой гипериммунной сыворотки.

Например, для получения гипериммунной противосибиреязвенной сыворотки используют лошадей в возрасте от 3 до 10 лет. Вначале здоровым животным вводят четырехкратно вакцину Ценковского II для создания стойкого иммунитета (грундиммунизация), а потом лошадей подвергают гипериммунизации вирулентной суточной бульонной культурой возбудителя сибирской язвы. Всего используют 12 вирулентных штаммов возбудителя, комбинируя их по четыре в виде смеси для каждой иммунизации.

Гипериммунизацию лошадей начинают с малых доз: 0,5; 1,0; 2,5 и 5,5 мл с интервалом в трое суток. Затем культуры возбудителя сибирской язвы вводят с интервалами в 3-4 суток и в дозах 10,0; 20,0; 40,0; 80,0; 100,0; 110,0; 120,0; 130,0; 140,0; 150,0 мл.

Обычно бывает достаточным ввести антиген 13 раз, и сыворотка лошадей-продуцентов становится активной. При введении доз от 10 до 80 мл к культуре добавляют 0,2 % алюминиевых квасцов, а к дозам от 100 до 150 мл - 0,1 % квасцов. При повышении у животных температуры тела интервал между инъекциям увеличивают до 4 или 5 суток.

В каждом конкретном случае схемы иммунизации могут быть разными. Схемы иммунизаций отличаются одна от другой даже при получении одной и той же сыворотки.

Специалисты сывороточного производства считают, что каждое животное отличается индивидуальной реактивностью организма и для него необходима своя, отдельная схема гипериммунизации.

Разнообразие схем иммунизации определяется, по мнению Г.Е. Синельникова (1978) следующим:

- различием методов введения антигена;

- дозировкой антигена;

- количеством инъекций;

- интервалами между инъекциями;

- объемом забираемой у животного крови;

- кратностью цикловых кровопусканий.

Введение антигенов обычно не вызывает резких отклонений в состоянии здоровья животных, лишь иногда наблюдаются местные и общие реакции. Эффективность иммунизации животных повышается при дробном введении антигенов одновременно в различные участки тела с охватом возможно большего количества лимфатических узлов.

По окончании гипериммунизации, когда в сыворотке крови животного установлен максимальный титр специфических антител, у него берут кровь обычно через 7-10 суток после последней инъекции антигена. Этот период соответствует максимальному накоплению антител в крови животных и полностью укладывается в закономерности иммуногенеза.

Количество забираемой крови зависит:

- от массы животного;

- от привычки его к кровопотерям с учетом начального и последующих циклов;

- количества предполагаемых кровопусканий в данном цикле;

- количества титра антител;

- состояния здоровья животного.

К взятию крови животных приучают постепенно.

Обычно при каждом крововзятии кровь берут из яремной вены из расчета800 мл на каждые 50 кг массы животного (или 13 % к общей массе крови животного).

Многочисленные эксперименты и клинические исследования свидетельствуют о том, что гемодинамика, эритропоэз, лейкопоэз, регенерация сывороточных белков, функциональное состояние различных органов при кровопусканиях в значительной мере зависит от дозы и кратности взятия крови.

Однократное кровопускание, в дозах не превышающих 1 % от массы тела животного, не вызывает заметных гемодинамических, гемоцитологических и биохимических сдвигов в ближайшие сроки от момента взятия крови.

В то же время установлено, что двукратное кровопускание стимулирует образование иммуноглобулинов М (IgМ), плазмоцитарную реакцию лимфоидных органов, влияет на уровень гамма- и бета- глобулинов, повышает синтез пропердина, лизоцима и бета-лизинов, увеличивает бактерицидность сыворотки крови и фагоцитарную активность лейкоцитов, повышает превентивные свойства сыворотки а также сопротивляемость организма инфекции.

Совершенно иным является эффект многократных взятий крови. Они приводят к изменению иммунных реакций. В частности, они стимулируют образование различных факторов иммунитета, но угнетают активность IgM-антител.

Тотальное обескровливание проводят тогда, когда решается вопрос о прекращении использования животных как продуцентов. Обычно это делают в момент максимального накопления антител и появления тенденции снижения их синтеза.

Перед тотальным взятием крови для получения её в наибольших количествах животным обычно вводят сердечные вещества. Но нужно отметить, что животные-продуценты могут пройти несколько циклов гипериммунизации (5-8) и решение вопроса о тотальном кровопускании принимается строго индивидуально.

Гамма – глобулинов

В предупреждении инфекционных болезней и лечении больных животных большую роль играют глобулиновые препараты. К ним относятся ''неспецифический'' (нормальный) гамма-глобулин, полученный из сыворотки крови здоровых животных, а также иммунные глобулины, выделенные из гипериммунных сывороток или сывороток переболевших животных (сыворотка животных-реконвалисцентов).

Огромное значение имеют глобулиновые препараты для сохранения новорожденного молодняка с/х животных.

Начиная с 1946 г., после того, как была установлена высокая эффективность гамма-глобулина при кори, в нашей стране стал выпускаться гамма-глобулин для медицинских целей. Медицинская промышленность, выпускала гамма-глобулин, полученный как из сыворотки крови человека, так и из сыворотки крови иммунизированных животных.

В конце 50-х годов было начато изучение профилактического и лечебного действия гамма-глобулинов в ветеринарии.

С 1962 г, на основании экспериментальных работ профессора Харьковского зооветеринарного института И.И. Лукашева и по его предложению, в нашей стране, впервые, на Орловской биофабрике было организовано производство гамма-глобулина против болезни Ауески из гипериммунной сыворотки.

Существует целый ряд комбинированных методов получения гамма-глобулиновых препаратов. Однако из большого числа предложенных методов получения гамма-глобулинов производственное значение имеют не многие. К ним относятся: солевой, спиртовой, риваноловый и спиртово-хлороформный.

Содержание гамма-глобулинов в сыворотке крови животных

Содержание гамма-глобулина в сыворотке крови животных различно и непостоянно. Оно подвержено не только индивидуальным колебаниям, но и, в значительной мере, зависит от упитанности, возраста, пола, породы, полового цикла, беременности, времени и условий исследований.

Особенно изменяется содержание гамма-глобулинов и белкового спектра сыворотки крови, в целом, при различных воспалительных процессах, инфекционных заболеваниях. Этот фактор является одним из диагностических признаков. Значительно увеличивается содержание гамма-глобулина при иммунизации животных, под воздействием введенного антигена.

Содержание белковых фракций в сыворотке крови у разных видов животных и человека представлены в таблице 3 (по Д.Л. Фердману).

Таблица 3

Содержание белковых фракций в сыворотке крови

Объект	Белковые фракции, в относительных %
альбумины	Глобулины
альфа	бета	гамма
Человек Корова Лошадь Свинья Овца Кролик Морская свинка	55.2 41.0 32.0 42.0 57.0 60.0 56.0	5.3 13.0 14.0 16.0 11.0 7.0 14.5	8.7 8.0 24.0 17.0 7.0 12.0 8.0	30.0 38.0 30.0 25.0 25.0 21.0 21.5

Изучением содержания белковых фракций в сыворотке крови здоровых животных занимался В.М. Красов (1969 Г.). Им, совместно с И.Н. Кацовой и Т.В. Малишевской, был изучен белковый спектр сыворотки крови семнадцати видов животных и пяти видов птиц.

При исследованиях также было установлено, что у молодых особей содержание гамма-глобулина значительно ниже, чем у взрослых, а у новорожденных он отсутствует совсем.

Литературные данные показывают, что изменения белковой картины крови начинаются с эмбрионального развития организма.

Так, например, у эмбрионов большой группы млекопитающих в сыворотке крови отсутствуют гамма-глобулины и встречается особый белок, открытый и названный Педерсоном фетуином. После рождения фетуин исчезает. У эмбрионов некоторых грызунов и приматов доказано наличие в сыворотке гамма-глобулинов в той же относительной концентрации, что и у взрослых, и отсутствие фетуина.

Различие в составе сывороточных белков у эмбрионов млекопитающих связанно с морфологическими особенностями строения плаценты. Гамма глобулины обнаружены в крови тех животных, у которых строение плаценты обеспечивает тесный контакт с кровью матери и зародыша и делает возможным переход гамма-глобулинов из материнской крови в кровь эмбриона. Фетуин же найден у млекопитающих с монослойной плацентой, через которую гамма-глобулин не может поступить в кровь эмбриона.

Так, например, в плазме новорождённого жеребёнка содержится 3,7 % белка, из них альбумина – 65 %, альфа-глобулина –32 %, бета-глобулина –3 %, а гамма-глобулина –0 % (Пенсон, 1943). Гамма-глобулин отсутствует и в сыворотке крови новорождённого телёнка, однако, через 18-20 часов после дачи молозива его содержание можно обнаружить биохимическими методами.

А.В.Соколов с сотрудниками (1956) обнаружил, что гамма-глобулины у поросят попадают в сыворотку крови только из молока матери и что новорождённые в течение 3 недель после рождения не способны самостоятельно продуцировать сывороточный гамма-глобулин. Были проведены и другие исследования, которые показали, что имеющиеся в молозиве гамма-глобулины сыворотки крови матери, очевидно, проникают в кровь сосунов через желудочно-кишечный тракт непереваренными.

Гамма-глобулина

В настоящее время разработан метод выделения гамма-глобулина методом ультрафильтрации. Для этого используют ультрафильтрационные модули на полых волокнах, отличающиеся пределом задержания по молекулярной массе на 5000, 15000, 50000, 100000 дальтон. В соответствии с этим используют модули УФУ-5, УФУ-15, УФУ-100, УФУ-50.

Для задержания гамма-глобулинов лучше использовать установку УФУ-100, обеспечивающую полную задержку гамма-глобулинов в фильтрате, т.к. молекулярная масса гамма-глобулина составляет 160000-900000 дальтон.

Производственные опыты по ультрафильтрации сыворотки дали возможность сконцентрировать её в 3 раза и практически без потерь иммуноглобулиновых компонентов (Школьников Е.Э. и др., 1996).

В условиях хозяйства

В условиях хозяйства можно легко и просто получить гамма-глобулин риваноловым методом и использовать его для профилактики болезней молодняка и лечения больных животных.

Например. Берут кровь от клинически здоровых коров хорошей упитанности (вакцинированных против различных инфекционных болезней; животных-реконвалесцентов, не являющихся микробоносителями; за 2 месяца до отела или через 2 недели после отела).

От одной коровы можно брать до 3 литров крови из яремной вены.

Кровь отстаивают при комнатной температуре до полного свертывания и отделяют сыворотку. К 100 мл сыворотки крови добавляют 30 мл 3 %-ного раствора риванола (этакридин лактат). Сыворотка мутнеет, в результате выпадения в осадок альбуминов, альфа- и бета-глобулинов, которые связываются с риванолом. Смесь сыворотки и риванола отстаивают в течение 30 минут в условиях холодильника (4° С). Затем в полученный раствор добавляют поваренную соль (NaCl) из расчета 0,5-0,8 % к объему раствора (0,65-1,04 г на 130 мл объема сыворотки с риванолом) для дополнительного осаждения балластных белков и уплотнения осадка. Смесь сыворотки, риванола и соли отстаивают в течение 1 часа при комнатной температуре и фильтруют через бумажные обеззоленные фильтры. На фильтре остаются альбумины, альфа- и бета-глобулины, а также риванол, в фильтрате - гамма-глобулин.

Раствор гамма-глобулина должен быть прозрачным, желтоватого или розоватого цвета. Препарат фасуют в стерильные стеклянные флаконы и закрывают резиновыми пробками. Флаконы и пробки стерилизуют кипячением в течение 1 часа.

Затем проводят контроль качества готового препарата.

В условиях хозяйства можно провести контроль на стерильность и безвредность полученного гамма-глобулина.

Для определения стерильности укупоренный флакон гамма-глобулина помещают в теплое место (возле батареи или калорифера) на 3 суток. Стерильный раствор гамма-глобулина через 3 суток останется прозрачным. Если раствор помутнел, значит в нем размножаются микроорганизмы. Всю полученную партию гамма-глобулина бракуют.

Для определения безвредности полученного гамма-глобулина, его вводят здоровому теленку в дозе 1,0 мл на 1 кг живой массы подкожно или внутримышечно. Если препарат безвреден, то изменений в общем состоянии животного не наблюдается.

Полученный гамма-глобулин применяют подкожно, для профилактики желудочно-кишечных и респираторных болезней молодняка животных в дозе 0,5 мл на 1 кг живой массы 1 раз в день 2 дня подряд, с терапевтической целью – в дозе 1,0 мл на 1 кг живой массы 1 раз в день 3 дня подряд. Первую инъекцию гамма-глобулина животному вводят дробно: вначале 1:10 дозы, через 15 минут (если не отмечаются отклонения в общем состоянии животного) вводят оставшееся количество препарата. Гамма-глобулин, полученный риваноловым методом, можно также давать животным внутрь.

Гамма-глобулин должен храниться при t = 4⁰ С, в темном месте. Срок годности 0,5-1,0 год с момента изготовления препарата.

Практическая работа

Список использованной литературы

1. Балашенко С. Г., Урбан В, П. Иммунные глобулины в ветеринарии.- Минск.- Урожай, 1972.

2. Кленина Н. В. Гамма-глобулины в ветеринарии.- Минск.-Урожай, 1971.

3. Коноковский А. И. Биохимия животных. - М., Колос.- 1992 .

4. Коляков Я. Е. Ветеринарная иммунология. - М., Агропромиздат.-1986.

5. Мешков Н.П., Северин С.И. Практикум по биохимии.- М., изд. МГУ, 1989.

6. Сафонов А.Ф., Пирожков Г. В. Получение и применение неспецифического гамма-глобулина. /Сб. науч. тр. КНИВИ, 1990.

7. Синицин В. А., Резуненко Е. В. Кириллов В. А. Фракционирование белков плазмы крови с целью препаративного получения гамма-глобулинов и альбумина - УААН, Институт экспериментальной клинической ветеринарной медицины, Харьков, 1995.

8. Тутов И. К Ситьков В. И. Основы биотехнологии ветеринарных препаратов. - Ставрополь, 1997.

9. Фримель Г. Иммунологические методы. -М.: Медицина 1987.

Содержание

1. Основы биотехнологии производства гипериммунных

сывороток…………………………………………………………………..7

1.1. Отбор животных-продуцентов. Грундиммунизация…..………..9

1.2. Гипериммунизация животных………………………………….13

1.3. Приготовление сывороточных препаратов…………………....16

2. Основы биотехнологии производства гамма – глобулинов………...19

2.1. Общие сведения о гамма-глобулинах………………………..…20

2.2. Содержание гамма-глобулинов в сыворотке крови животных.22

2.3. Связь гамма-глобулина с антителами…………………..………24