Диагностические методы и объекты исследования

Физиологические жидкости. Большинство сведений о врожденных «ошибках» метаболизма и методах их выявления было получено в результате химических исследований крови или мочи, позволивших обнаружить специфические биохимиче­ские нарушения и во многих случаях открыть пути к изучению ферментов и вы­яснению конкретного дефекта. Они дали также возможность скрининга крупных популяций, облегчив тем самым выявление больных еще до появления у них явных клинических симптомов. Использование методов скрининга по крови и моче позволило обнаружить гетерозиготных носителей многих заболеваний. Эти методы часто помогают также проследить эффекты некоторых диетических и лекарствен­ных средств или заместительной терапии.

Анализ тканей. Определение ферментов и биохимические исследования тканей человека, полученных путем биопсии, позволили обнаружить специфические фер­ментные нарушения более чем при 100 метаболических аномалиях. При таких заболеваниях, как наследственный сфероцитоз, цистинурия и синдром нарушения всасывания глюкозы — галактозы, in vitro были выявлены и нарушения мембран­ного транспорта. Эти исследования в дополнение к доказательствам аномальности продуктов отдельных генов часто позволяют идентифицировать биохимическую и генетическую гетерогенность, свойственную врожденным «ошибкам» метаболизма.

Исследования тканей не годятся для популяционных обзоров и оказываются наибо­лее полезными, если сочетаются с выявлением изменений в крови и моче.

Клеточные культуры. Существенный вклад в биохимию и генетику врожден­ных метаболических аномалий внесли также исследования на растущих в тканевой культуре фибробластах человека. В некоторых случаях (акаталазия, галактоземия, недостаточность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, болезнь накопления гликогена II типа, экскреция с мочой повышенного количества кетокислот с разветвленной цепью или оротовой кислоты) ферментные нарушения, ранее выявленные в других тканях, были подтверждены на культуре фибробластов. При цитруллинемии и болезни Рефсума специфические ферментные аномалии вначале были обнаружены именно в фибробластах, а при синдроме Леша—Найхана нарушение активности гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы было выявлено одновременно в эритроцитах, лейкоцитах и культивируемых фибробластах. Имеют значение и ано­малии, определяемые в клетках гетерозиготных носителей. Например, исследование облигатных гетерозигот по ряду сцепленных с Х-хромосомой признаков позволило получить подтверждение справедливости гипотезы Лиона.

Анализ ДНК. Использование методики блот-гибридизации ДНК—ДНК для диагностики наследственных метаболических нарушений явилось наиболее важным вариантом применения технологии рекомбинантной ДНК в медицине (см. гл. 58). Этот подход основывается на выделении ДНК из легко доступных тканей, на­пример лейкоцитов периферической крови, культивируемых фибробластов или клеток амниотической жидкости. После расщепления ДНК рестрикционными эндонуклеазами и определения размеров полученных фрагментов с помощью гель-электрофореза проводят реакцию с мечеными зондами к специфическим генам из конкретных локусов, ответственным за конкретные нарушения. Если моле­кулярный дефект, лежащий в основе нарушения, точно известен, как, например, при серповидно-клеточной анемии или Z-варианте a₁-антитрипсина, то можно подобрать строго определенные олигонуклеотидные зонды. В других случаях диагностика осуществляется легче путем регистрации полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, подразделяемых на семейства и служащих полезными маркерами болезни (см. гл. 58). Этот подход использован для диагностики болезни Гентингтона, фенилкетонурии, цитруллинемии, синдрома Леша—Найхана и недостаточности орнитинтранскарбамилазы.

Выявление гетерозигот. Выявление гетерозиготных носителей двояко влияет на изучение врожденных дефектов. Во-первых, оно наглядно доказывает рецессив­ность наследования заболевания независимо от того, является ли мутация ауто­сомной или сцепленной с Х-хромосомой. Во-вторых, идентификация гетерозигот­ных носителей в одной семье позволяет получить важные сведения для генетиче­ского консультирования ее членов. При заболеваниях, при которых у носителей могут появиться клинические признаки (т. е. при доминантно наследуемых де­фектах, таких как острая перемежающаяся порфирия или семейная гиперхолесте­ринемия), выявление гетерозигот имеет непосредственное клиническое значение.

Гетерозигот можно идентифицировать с помощью многих методов, исполь­зуемых для выявления дефектов у больных. В некоторых случаях для выявления носителя достаточно применить методы скрининга проб крови или мочи. В других полезными оказываются ферментативные методы. При ряде заболеваний анализ крови или мочи не позволяет разграничить здоровых лиц и гетерозиготных носи­телей, но последних помогают выявить пероральные или парентеральные нагрузки предшественником в цепи нарушенной химической реакции. Так, гетерозиготы по галактоземии и фенилкетонурии реагируют на пероральную нагрузку соответст­венно галактозой и фенилаланином более высоким уровнем их в плазме по сравне­нию со здоровыми. Носители ряда заболеваний выявляются с помощью фер­ментативных методов или по фенотипу клеток в биоптатах. Наконец, для их вы­явления и, что важно, для исключения носительства часто применяют методы гибридизации ДНК—ДНК. Обычно этими методами пользуются лишь в одном или в немногих центрах. В силу их сложности они не применяются для выявления носителей в крупных популяциях.

Пренатальные исследования. В настоящее время большой интерес вызывает выявление генетических болезней во внутриутробном периоде (см. гл. 58). Хими­ческое исследование амниотической жидкости или ферментативный анализ ее кле­ток позволил идентифицировать более 50 врожденных метаболических нарушений.

Наиболее многочисленную группу заболеваний, выявленных этим методом, состав­ляют болезни накопления мукополисахаридов и липидов, обусловленные недоста­точностью отдельных лизосомных гидролаз. Однако этим способом идентифициро­ваны и нарушения метаболизма амино- и органических кислот, углеводов и пуринов. Несколько врожденных аномалий установлено путем исследования крови плода, полученной при пункции плаценты или фетоскопическом контроле. Таким путем выявлены серповидно-клеточная анемия, b-талассемия и гемофилия. Если все эти подходы основаны на исследовании генных продуктов или метаболитов, то диагно­стика других нарушений осуществляется с помощью методики блот-гибридизации ДНК—ДНК. Последние методики особенно перспективны, так как позволяют ис­пользовать клетки, например, амниотической жидкости в культуре, которые содер­жат, но не экспрессируют гены, осуществляющие многие высокодифференциро­ванные функции, включая синтез глобина и полипептидных гормонов. Блот-гибридизация ДНК—ДНК применялась для пренатального выявления фенилкетонурии, недостаточности а i-антитрипсина, гемофилии, серповидно-клеточной анемии, талас­семии и недостаточности орнитинтранскарбамилазы.

Генетический скрининг

Генетический скрининг представляет собой обследование популяции на пред­мет выявления лиц, обладающих генотипом, о котором известно, что он связан либо с болезнью, либо с предрасположением к ней у человека или его потомства. В научно-исследовательском плане скрининг может дать представление о частоте определенного генотипа в популяции и о полиморфизме заболевания. Однако в контексте рассмотрения врожденных метаболических нарушений скрининг при­меняется с двумя важными целями: для раннего выявления лиц с риском курабельного заболевания еще до появления клинической симптоматики и для идентифи­кации пар с риском заболевания у потомства, которые могут извлечь пользу из генетического консультирования. Характерным примером первой цели служит неонатальный скрининг на фенилкетонурию. В этом случае скрининг оправдывается относительно высокой частотой заболевания (примерно 1:10000 среди представите­лей европеоидной популяции), тяжелыми клиническими последствиями (резкая задержка психического развития), свидетельством того, что ограничением фенил­аланина в диете до 30-дневного возраста можно снизить концентрацию фенилалани­на в крови до уровня, обеспечивающего нормальное или почти нормальное психи­ческое развитие, а также специфичностью существующего метода диагностики заболевания в неонатальном периоде. Более 90 % новорожденных в Северной Америке и Западной Европе обследуются на фенилкетонурию с помощью метода ингибирования бактериального роста. Эта программа скрининга требует огромных кадровых и экономических затрат, она быстро распространилась на неонатальное выявление других курабельных заболеваний, таких как галактоземия, гипотиреоз и гомоцистинурия. Такого рода меры, необходимые для «вторичной» профилактики, подчеркивают значение взаимодействия между окружающей средой и наследст­венностью для проявления болезни и не сопряжены с серьезными этическими проблемами.

Последнего, однако, нельзя сказать о другой цели скрининга: выявления супру­жеских пар, для потомства которых характерен риск неизлечимых (или почти неизлечимых) заболеваний. Примером служит болезнь Тея—Сакса у евреев ашкенази. При вступлении в брак двух ашкенази вероятность того, что оба супруга являются носителями гена болезни, составляет 1:900. Теоретически, если бы все ашкенази обследовались до брака, если бы при всех беременностях в семьях с риском этого заболевания проводилась пренатальная диагностика и если бы все больные плоды подвергались аборту, то частота болезни Тея—Сакса должна была бы снизиться до нуля. Однако проводить скрининг в законодательном порядке невозможно, а добровольно на обследование соглашаются немногие. Для успеха этого мероприятия решающее значение имеют образование, мотивация и эффектив­ный катамнез. Аналогичные программы осуществляются среди представителей негроидной популяции, в которой у каждой из 100 супружеских пар существует риск рождения ребенка с серповидно-клеточной анемией. Прежние программы были не только неэффективны, но даже вредны из-за недостаточной разъяснительной работы перед обследованием, из-за непонимания различий между маркером сер­повидно-клеточной анемии и самим заболеванием, а также из-за ограничений, испытываемых больными при приеме на работу и страховании жизни. Крах этих мероприятий указывает на значение этических и социальных аспектов подобных программ скрининга.

Лечение

Многие больные с наследственными метаболическими дефектами, особенно если выяснены их биологические основы, легко поддаются лечению. По мере уве­личения объема знаний о мутациях, ответственных за конкретные заболевания, и о химических последствиях этих мутаций наверняка появится возможность с помощью специальных лечебных программ компенсировать или менять течение и других врожденных аномалий. Лечение преследует две цели: первая предусматри­вает воздействие на сам генотип больного, вторая — изменение окружающей среды таким образом, чтобы смягчить вредный эффект мутантного фенотипа. До на­стоящего времени успехи в лечении связаны лишь со вторым подходом. Несмотря на то что возможность изменения генотипа и вызывает значительный интерес, клиническое использование этого подхода остается всего лишь надеждой.

Успех терапии на фенотипическом уровне связан с рядом условий. Прежде всего необходимо установить правильный диагноз. Некоторые врожденные нару­шения, такие как фенилкетонурия, имеют безвредные фенокопии, характери­зующиеся транзиторными, но аналогичными биохимическими изменениями у ново­рожденных. Если при истинной фенилкетонурии диета с низким содержанием фенилаланина смягчает осложнения со стороны центральной нервной системы, то у новорожденных с. транзиторной гиперфенилаланинемией из-за задержки созре­вания фенилаланингидроксилазы она может оказать катастрофическое действие на рост и развитие. Затем врач должен быть убежден, что аномалия опасна для здоровья и требует проведения лечебных мероприятий. Как уже упоминалось, некоторые врожденные аномалии, например, пентоз- или иминоглицинурия, не сопровождаются сколько-нибудь существенными клиническими проявлениями и лечения при них не требуется. Наконец, любую терапевтическую программу необходимо постоянно оценивать на предмет вредных последствий, равно как и для доказательства ее эффективности. Иногда это трудно разделить. При болезни Уилсона пеницилламин является эффективным средством, так как образует хелаты с медью; он также способствует растворению цистина и предотвращает образование камней при цистинурии. К сожалению, препарат вызывает и вредные эффекты, что снижает его ценность и требует тщательного медицинского наблюдения.

Методылечения. Модификация фенотипа достигается многими путями, кото­рые зависят от характера аномалии и сроков проявления ее эффектов. Методы лечения бывают консервативными и хирургическими, причем по разнообразию и опыту использования первые значительно превосходят вторые.

Исключение препаратов. При некоторых аномалиях клинические последствия можно смягчить или полностью предотвратить, исключив определенные воздействия внешней среды. Например, приступы гемолиза у больных с недоста­точностью Г-6-ФД можно значительно ослабить, исключив прием таких препаратов, как примахин или сульфаниламиды,, и таких пищевых продуктов, как бобы. Точно так же продолжительная остановка дыхания после введения сукцинилхолина у лиц с недостаточностью псевдохолинэстеразы не наступает, если это анестезирующее средство не применять. Примерами аналогичного подхода служит исключение барбитуратов и многих других препаратов из используемых при острой интермитти­рующей порфирии, а также отказ от курения и вдыхания других вредных дымов при недостаточности a i-антитрипсина.

Ограничения. Известны многочисленные аномалии, при которых феноти­пические изменения связаны с накоплением отдельных субстратов или побочных продуктов их метаболизма. Проявления этих аномалий можно смягчить путем ограничения потребления соответствующих субстратов или их предшественников, если, конечно, субстрат служит незаменимым компонентом диеты и, следовательно, не вырабатывается организмом. К примерам врожденных дефектов, эффективно корригируемых таким образом, относятся фенилкетонурия, повышенная экскреция с мочой кетокислот с разветвленной цепью (кетоацидурия), гомоцистинурия, галактоземия, эссенциальная фруктозурия и болезнь Рефсума. Подобно этому, больные с нарушением всасывания глюкозы и галактозы, у которых при потребле­нии пищи, содержащей лактозу, развивается тяжелая диарея, чувствуют себя впол­не удовлетворительно при изменении источника пищевых углеводов. Напротив, диетические ограничения не помогают при гиперпролин-, гидроксипролин- или цитруллинемии, поскольку соответствующие аминокислоты в большом количестве синтезируются de novo. Даже при состояниях, при которых диетические огра­ничения могут принести пользу, возникает вопрос об их продолжительности. Вред­ное влияние избытка фенилаланина, галактозы и аминокислот или кетокислот с разветвленной цепью может проявляться лишь в первые годы жизни, когда ско­рость развития и организации функций головного мозга максимальна. Если это так, то после определенного возраста диетические ограничения следовало бы осла­бить или вообще отменить. Более четкие рекомендации требуют большего клини­ческого опыта.

Заместительная терапия. Многие болезни, связанные с неспособ­ностью организма синтезировать определенные белки или продукты с низкой молекулярной массой, легко поддаются заместительной терапии. К врожденным дефектам, корригируемым при парентеральном заместительном введении белка, от­носятся гемофилия и агаммаглобулинемия. Эффективность заместительной терапии в этих случаях обусловлена тем, что в крови здорового человека содержится избы­ток отсутствующих у больных белков. Однако в большинстве случаев аномальный белок или фермент локализуется только в какой-то одной из внутриклеточных органелл и содержится в ней в очень малом количестве. В этих случаях замести­тельная терапия затруднительна или вообще невозможна по трем причинам: во-первых, из-за трудности очистки или синтеза больших количеств специфиче­ского белка, во-вторых, из-за того, что простое парентеральное введение белка не обеспечивает его поступления в необходимую часть клетки, в-третьих, из-за того, что белок может обусловить вредные иммунологические реакции. Несмотря на эти трудности, попытки подобного лечения продолжаются. Например, в некоторых случаях при болезни Гоше внутривенно вводят очищенную глюкоцереброзидазу человека. У больного при этом умеренно снижается уровень глюкоцереброзидов в тканях, свидетельствующий о том, что какая-то доля фермента поглотилась клет­ками и за короткое время оказала внутриклеточное действие. Углубление знаний о механизмах поступления белков в различные клеточные органеллы будет способ­ствовать совершенствованию стратегии заместительной терапии.

Клинические проявления болезни могут быть связаны не с белком, синтез которого нарушен, а с продуктом заблокированной метаболической реакции. При ряде вариантов врожденной гиперплазии надпочечников блокируется синтез корти­зола, и заместительная терапия этим стероидом приводит к резкому улучшению состояния больного. Точно так же введение тиреоидных гормонов и уридина ку­пирует тяжелые клинические проявления соответственно семейного зобного крети­низма и избыточной экскреции с мочой оротовой кислоты.

Добавки. При некоторых метаболических нарушениях улучшение клиниче­ского состояния и/или коррекция биохимических показателей происходят при назначении дополнительных количеств тех или иных витаминов. Впервые это было установлено при наблюдении за больными детьми, у которых приступы удавалось купировать только сверхфизиологическими дозами пиридоксина. В настоящее вре­мя известно более 20 нарушений, корригируемых добавками того или иного вита­мина. Большинство из них обусловлено первичными ферментными дефектами, заключающимися в нарушении сродства к кофактору. Другие определяются пер­вичными нарушениями путей синтеза кофермента или метаболита из предшест­венника-витамина. В эту категорию входит ряд аномалий, корригируемых кобаламином (витамин B12), фолатом или витамином D. Опыт продолжительного приме­нения витаминных добавок пока еще ограничен.

Лекарственные препараты. Клинические проявления некоторых врожденных нарушений метаболизма обусловливаются накоплением определенных веществ в одной или нескольких тканях. Лечение при этом может быть эффектив­ным в результате либо повышения экскреции накапливающихся химических соединений, либо блокады их образования. Накопление меди при болезни Уилсона можно блокировать с помощью таких средств, как пеницилламин, образующий хелаты с медью и усиливающий ее экскрецию. Экскреция железа при гемохрома­тозе увеличивается после флеботомии и под действием деферроксамина. Пени­цилламин способствует также растворению кристаллов цистина при цистинурии, реагируя с этой аминокислотой и образуя более растворимый дисульфид цистеинпеницилламин. В этом случае количество экскретируемого цистина не меняется, но его химическая форма модифицируется благоприятным образом. Отложения моче­вой кислоты при подагре уменьшаются при лечении как лекарственными препа­ратами, повышающими ее экскрецию (например, сульфинпиразол и пробенецид), так и ингибиторами метаболизма (например, аллопуринол), тормозящими биосин­тез мочевой кислоты.

Хирургическое лечение. К хирургическим методам прибегают лишь при немногих состояниях, например при подагре, цистинурии и оксалозе, при которых нефро- или уретеролитотомия может значительно уменьшить проявления болезни, пока не начато проведение других лечебных мероприятий. Согласно данным ряда авторов, при некоторых заболеваниях полезной оказывается пере­садка органов. Так, при цистинозе, гипероксалурии и болезни Фабри производили пересадку почек. Цель операции заключалась в восстановлении почечной функции при состояниях, сопровождающихся прогрессирующими и в конечном счете ле­тальными повреждениями почек. Результаты при этом неоднозначны. При ги­пероксалурии пересаженная почка оказалась разрушенной отложениями оксалатов. При цистинозе этого не происходило. Вторая цель пересадки заключается в восста­новлении нарушенной функции. Так, при комбинированном иммунодефиците под­садка печеночных клеток плода или тимоцитов сопровождается улучшением кли­нического состояния. Аналогичные положительные результаты пересадки костного мозга известны и йри других иммунодефицитах и р-талассемии. В будущем боль­ным с гемофилией или агаммаглобулинемией можно будет, вероятно, транспланти­ровать селезенки. Длительный эффект операции должен определяться присут­ствием постоянного источника антигемофилического глобулина или гамма-глобу­лина соответственно. Подобным образом для лечения болезни Уилсона, тирозинемии и гомозиготной формы семейной гиперхолестеринемии с успехом транспланти­ровали печень. Этот подход следует, конечно, испытать и при других врожденных дефектах, поскольку при таких состояниях, как болезнь накопления гликогена, повышенная экскреция с мочой кетокислот с разветвленной цепью и дефекты фер­ментов мочевинного цикла, соотношение риска оперативного вмешательства и его положительных эффектов сдвигается в сторону последних.