Строение и функция фолликулов, яйцеклетки и желтого тела

Фолликул яичника (лат. folliculus ovaricus) — структурный компонент яичника, состоящий из яйцеклетки, окружённой слоем эпителиальных клеток и двумя слоями соединительной ткани.

Ооцит

В фолликуле содержится ооцит 1-го порядка. Ядро ооцита называют "зародышевый пузырёк" germinal vesicle (см. иллюстрацию)

Гранулёзные клетки

Ооцит окружён слоем гликопротеинов, zona pellucida (zona striata). Он, в свою очередь, окружён слоем гранулёзных клеток.

Тека-клетки

Гранулёзные клетки окружены тонким слоем внеклеточного матрикса — базальной мембраной (на рисунке обозначена, как fibro-vascular coat). Вокруг базальной мембраны находятся тека-клетки.

Жёлтое тело яичника (лат. corpus luteum) — временная железа внутренней секреции в женском организме, образующаяся после овуляции и вырабатывающая гормон прогестерон. Название жёлтое тело получило благодаря жёлтому цвету своего содержимого.

Образование жёлтого тела из гранулёзных клеток фолликула яичника происходит в лютеиновую фазу менструального или эстерального цикла после выхода яйцеклетки из фолликула. Образование железы происходит под влиянием лютеинизирующего гормона, секретируемого клетками передней доли гипофиза. Во второй половине менструального цикла жёлтое тело вырабатывает небольшое количество эстрогена и прогестерон, гормон жёлтого тела.

Под воздействием прогестерона слизистая оболочка матки (эндометрий) подготавливается к возможной беременности и имплантации оплодотворённой яйцеклетки. Если оплодотворение не произошло, через несколько дней железа начинает уменьшаться в размерах, перерождается в рубцовую ткань и вырабатывает всё меньшее количество прогестерона, что в итоге ведёт к началу менструации. Участок рубцово-перерождённой ткани называется «беловатым телом» (corpus albicans), которое впоследствии исчезает. Большое количество беловатых тел придаёт яичнику характерную рубцовую структуру поверхности.

Если оплодотворение произошло, под влиянием хорионического гормона жёлтое тело (теперь оно называется corpus luteum graviditatis) остаётся активным в течение 10-12 недель, вырабатывая необходимый для развития и сохранения беременности прогестерон, который стимулирует рост эндометрия и предотвращает выход новых яйцеклеток и менструацию. Жёлтое тело сохраняется до тех пор, пока плацента не будет в состоянии самостоятельно вырабатывать эстроген и прогестерон.

Яйцеклетки млекопитающих неподвижны и имеют значительно большие размеры, чем спермии. Это обусловлено и большей массой ци­топлазмы, и, главным образом, наличием запасного питательного мате­риала в виде желтка (дейтоплазмы). Этот материал представлен желточ­ными гранулами и пластинками. Состоит из белков, фосфолипидов и нейтральных жиров. Желток может находиться в цитоплазме яйцеклетки или быть обособленным от цитоплазмы, образуется в печени и других органах и через кровь поступает в ооцит.

Яйцеклетка, вышедшая из фолликула, вскоре погибает, если не бу­дет оплодотворена. Уже в период прохождения истмической части яйцепровода цитоплазма в ядре клетки распадается на отдельные фрагменты и после размягчения прозрачной оболочки постепенно рассасывается. Происходит это уже в матке, куда неоплодотворенные яйцеклетки попа­дают примерно в то же время, когда и оплодотворенные. У кобыл опло­дотворенные клетки остаются в яйцепроводах, где подвергаются медлен­ной (в течение нескольких недель или даже месяцев) цитоплазматической дегенерации. У этого вида животных развивающийся зародыш ока­зывает, по-видимому, более мощное эндокринное (или иное) влияние на функцию яйцепроводов, что позволяет ему проникнуть в матку, тогда как неоплодотворенная клетка туда не проходит. Продолжительность жизни яйцеклетки коровы составляет 10–12 ч, овцы — 12–15 ч, лошади — 8–10 ч, свиньи — 6–156 ч. В течение этого периода яйцеклетка может быть опло­дотворена, но чаще способность к оплодотворению сохраняется более короткое время и обычно не превышает 6 ч. Сущность процесса оплодотворения, факторы влияющие на него

Трансплантация зародышей – оценка зигот и их хранение. Время и техника пересадки зигот

ОЦЕНКА, КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ЗАРОДЫШЕЙ

Специальные исследования свиде-тельствуют, что частота отклонений от нормы у яйцеклеток, выделившихся во время суперовуляции, более высокая, чем при овуляции у животных без гормональных обработок. Поэтому после суперовуляции оплодотворяются не все яйцеклетки, а из оплодотворившихся яйцеклеток не всегда развиваются полноценные зародыши, пригодные к пересадке. В связи с этим для достижения высоких результатов отбирают зародышей, способных к дальнейшему развитию в организме реципиента. Наиболее широкое распространение получили способы оценки качества и жизнеспособности зародышей по морфологическим признакам и по результатам их культивирования.

Морфологическую оценку зародышей проводят с использованием инвер-тированного микроскопа МБИ-13. При этом учитывают соответствие стадии развития зародыша его возрасту, целостность и форму прозрачной оболочки, равномерность дробления бластомеров и состояние их цитоплазмы, величину и прозрачность перивителлинового про-странства. Зародыши с признаками де-генерации, уродств и недоразвития для пересадок непригодны. (Подробно методика изложена в «Практикуме по акушерству, гинекологии и искусственному осеменению сельскохозяйственных животных».)

После морфологической оценки за-родышей до пересадки можно кратко-временно хранить в термостате при тем-пературе 37 °С. При этом их помещают на часовое стекло в 0,5 мл среды Дюль- бекко с добавлением 20 % фетальной сыворотки теленка или сыворотки овцы. Часовые стекла с зародышами ставят в чашки Петри, на дно которых кладут увлажненную фильтровальную бумагу. Таким образом сохраняется жизнеспособность зародышей и обеспечивается возможность более точного выявления их полноценности.

Для замораживания зародышей готовят среду из следующих компонентов (в г/л): натрия хлорид 8,0; калия хлорид 0,2; гидроортофосфат (динат- рийфосфат) безводный 1,15; дигидроортофосфат (монокалийфосфат) одно- замещенный 0,2; магния хлорид, содержащий 6 молекул воды, 0,1; калия хлорид безводный 0,1; натрия пируват 0,076; глюкоза 1,0. В этот раствор добавляют 20 % фетальной сыворотки крови теленка и 100 тыс. ЕД/л пенициллина (калиевой соли). Среду готовят в стерильных условиях в день применения. Часть среды используют для приготовления рабочего раствора (к 8 мл среды добавляют 1000 ЕД пенициллина и 2 мл фетальной сыворотки). Затем готовят серию растворов с разной концентрацией глицерина по ме-тодике, изложенной в инструкции, и насыщают зародыш глицерином одно- или многоступенчатым способом. Этот процесс контролируют под микроскопом в стерильных условиях при температуре 20 °С, после чего зародыши сразу замораживают в стеклянных пробирках или ампулах, пластиковых соломинках, которые маркируют.

Охлаждение проводят в несколько этапов: 1) снижают температуру от 20 °С до минус 5—7 °С со скоростью 1—10 °Св 1 мин; 2) при минус 6—7 °С проводят ис-кусственную кристаллизацию, касаясь пинцетом, переохлажденным в жидком азоте, поверхности контейнера с заро-дышами; 3) продолжают охлаждать со скоростью 0,3 °С в 1 мин до минус 36 °С; 4) погружают в жидкий азот для быстрого охлаждения до минус 196 °С. Хранят замороженные эмбрионы в сосудах Дьюара. Для оттаивания емкости с зародышами быстро переносят в водяную баню с температурой 25—37 °С и держат до исчезновения льда.

Вместе с раствором криопротектора эмбрион помещают на часовое стекло, предварительно оценивают под лупой и удаляют криопротектор, помещая зародыш в заранее приготовленные растворы глицерина убывающей концентрации. Затем еще раз оценивают качество зародышей под микроскопом. Когда эмбрионов замораживают в соломинках с раствором глицерина и сахарозы, то после оттаивания соломинку несколько раз встряхивают (подобно термометру). При этом пробка, закрывающая соломинку, должна быть направлена вверх. Для уравновешивания осмотического давления и удаления криопротектора из зародыша соломинку помещают вертикально (пыжом вверх) в водяную баню с температурой 25—37 °С. Затем приступают к пересадке эмбриона (Н. И. Сергеев, С. А. Мазепкин).

Разработаны и другие способы куль-тивирования зародышей вне организма, позволяющие сохранять их жизнеспо-собность до 24—48 ч. Зародышей можно культивировать в пробирках, а также в ампулах и пайетах из поливинилхлорида. До 4—7 дней сохранить их можно в перевязанном яйцепроводе кролика. Однако наиболее перспективным методом является глубокое замораживание зародышей в жидком азоте при температуре минус 196 °С. Зародыши крупного рогатого скота лучше других переносят замораживание и размораживание; выживаемость — 50—70 %.

Пересадка в след вопросе

Трансплантация зародышей, цели, задачи. Подготовка доноров и реципиентов, приемы пересадки

Под трансплантацией зародышей понимают перенос зародышей из половых органов животных-доноров в половые органы животных-реципиентов. При этом в организме реципиентов наступает нормальная беременность с развитием зародышей, а затем и плодов.

Работы по трансплантации зародышей были начаты в конце XIX в. на кроликах с целью изучения развития плода и влияния организма матери на его развитие (Хипп, 1891). В. С. Груздев (1897) предпринял первые попытки по оплодотворению яйцеклеток и инкубации зародышей млекопитающих вне организма. В дальнейшем эти опыты продолжали многие отечественные и зарубежные ученые. А. В. Квасницкий впервые в мире (1949—1953 гг.) получил потомство у свиней после пересадок яйцеклеток и зигот. Под руководством А. И. Лопырина осуществлялись успешные пересадки зародышей овец. Появились публикации о пересадках оплодотворенных и неоплодотворенных яйцеклеток кроликов, коз, коров, лошадей. Практиковался хирургический метод получения и пересадки свежих зародышей.

С 1970 г. научные исследования и практическое применение трансплантации зародышей начали быстро развиваться. В 1971 г. проведены успешные опыты по замораживанию и оттаиванию зародышей мышей, а в 1973 г. родился первый теленок после пересадки корове замороженного и оттаянного зародыша.

За Шлет (1973—1982 гг.) в Канаде по-лучили 5413 телят-трансплантатов, а в США в 1990 г., когда они были в числе 35 стран (830 членов) Международного общества трансплантации зародышей (МОТЗ, 1984), — уже 500 тыс., в СССР к 1990 г. — 12 тыс.

В последние 12 лет в области транс-плантации зародышей достигнуты ре-кордные результаты: в США от коровы- донора за год получено 136 телят, во

Франции — 80, в Германии — 57; в Рос-сийской Федерации в ВИЖ — от 44 доноров 261 теленок, на Украине в НИИЖЛиП — от 6 доноров 71 теленок.

В России образованы областные центры трансплантации зародышей и стабильно получают телят-трансплантатов в Воронеже (Ю. А. Скрипицын, 1992), Туле (1987), Омске (Т. А. Авдеева, 1994), а также создан республиканский центр трансплантации зародышей в Татарстане РЦТЗ (Р. М. Саитов* 1995) и других республиках.

Современные методы суперовуляции позволяют увеличить в 10—20 раз число образующихся в яичниках яйцеклеток: у коров и овец — до 25, у свиней — до 40— 45, у лошадей —до 5, у грызунов —до 90. В Англии еще в 1983 г. от коровы за один раз извлекли 27 зародышей и, пересадив их реципиентам, получили 19 телят. Разрабатываются новые методы получения зародышей монозиготных близнецов (С. В. Вилладсон, Кэмб- ридж): двоен от коров, лошадей, свиней, овец, а в последние годы и из 4—8-клеточных зародышей — четверен коров и овец. Получены 5 пар половинных однояйцовых близнецов и 46 близнецов из четвертых частей зародышей. За год от донора можно получать по 4—6 зачатий.

Длительное сохранение зародышей позволяет создавать запасы (банки заро-дышей) ценного генетического фонда и экспортировать или импортировать за-родышей высокопродуктивных и редких пород животных. Пересадка зародышей животных мясных пород молочным коровам имеет неоспоримое преимущество по сравнению со скрещиванием мясных быков с такими коровами и, следовательно, будет способствовать увеличению производства говядины. Возможно получение двоен путем пересадки по одному зародышу в каждый рог матки или введением дополнительного зародыша в небеременный рог матки. Можно получать ценный в пле-

Отборменном отношении приплод от коров местных пород, имеющих иммунитет к различным болезням.

Пересадку зародышей можно ис-пользовать и для изучения многих вопросов физиологии и патологии беременности, межвидовой гибридизации. Например, после пересадки овцам зародышей коз рождаются нормальные козлята, а от коз после трансплантации им зародышей овец — ягнята.

Однако преимущество от трансплан-тации зародышей в условиях хозяйства достигается только при четком повсед-невном осуществлении комплекса агро- зооветорганизационных мероприятий. Важнейший элемент его — наличие здо-ровых, конституционально крепких доноров и реципиентов, обеспеченных полноценным кормлением, хорошим

содержанием и правильной эксплуатацией; высококвалифицированных аку- шеров-гинекологов; специального центра (пункта) трансплантации зародышей с необходимым оборудованием и оснащением.

Работу по трансплантации проводят в следующем порядке:

отбор доноров и реципиентов; вызывание множественной овуляции (суперовуляции) у доноров и их осеменение;

получение зародышей от доноров; оценка, культивирование и хранение зародышей;

синхронизация полового цикла ре-ципиентов с половым циклом доноров;

пересадка зародышей на стадии мо- рулы или бластулы реципиентам

ОТБОР ДОНОРОВ

Донор — это высокоценное, выдающееся животное, от которого после гормонального вызывания полиовуляции и осеменения спермой проверенного про-изводителя-улучшателя получают не-сколько зародышей. Отбирают только тех животных, которые обладают способностью к множественной овуляции и дают в течение длительного срока их использования большое количество зародышей, пригодных к пересадке. В качестве доноров лучше использовать здоровых коров в возрасте от 4 до 5 лет с хорошо развитой молочной железой, пригодной к машинному доению, и у которых не было каких-либо осложнений родов и послеродового периода. Первая стадия возбуждения полового цикла после родов должна быть синхронной и полноценной, с ярко выраженными фе-номенами: течки, полового возбуждения и охоты.

Операция пересадки зародышей эко-номически выгодна только в том случае, когда в качестве доноров берут выдаю-щихся в племенном отношении животных. В некоторых случаях для получения зародышей рекомендуют использовать ценных в племенном отношении коров в заключительные сроки их продуктивной жизни, чтобы получить от них больше потомков.

ВЫЗЫВАНИЕ СУПЕРОВУЛЯЦИИ

Теоретические исследования и опыт проведения пересадок зародышей в производственных условиях показали, что для широкого распространения этого метода в практике необходимы надежные источники получения оплодотворенных яйцеклеток или зародышей на ранних стадиях развития.

В решении данной задачи имеются два принципиальных подхода. Первый подход — это обеспечение множественной овуляции, или полиовуляции, у коров, ремонтных телок и у молодых тело- чек до наступления половой зрелости; второй подход, находящийся пока в стадии разработки, — изыскание способов извлечения яйцеклеток непосредственно из яичников с дальнейшим созданием условий для их созревания и оплодотворения in vitro. В настоящее время в практике используется в основном первый способ. Животным, обычно в середине полового цикла, вводят препараты гонадотропных гормонов, вызывающих усиленный рост и развитие многих пузырчатых фолликулов и их овуляцию на фоне обратного развития желтого тела.

Суперовуляцию считают достигнутой, если произошло выделение не менее трех яйцеклеток (в отдельных случаях у животных их овулирует 100 и более). Однако основная цель гормональной обработки — получение в результате су-перовуляции 10—20 яйцеклеток.

У коров и телок для вызывания мно-жественной овуляции применяют гона-дотропины гипофизарного и плацентарного происхождения; для обработки используют разнообразные схемы. Наиболее эффективны гонадотропины сыворотки жеребых кобыл (ГСЖК). Они вырабатываются в оболочках плода осо-быми клетками, которые внедряются в эндометрий кобылы примерно с 36-го по 40-й день беременности. Гонадотропины выделяются в кровь матери. Наиболее высокое содержание ГСЖК в крови кобыл отмечается примерно с 60-го по 90-й день беременности. Гонадотропины СЖК лучше всего применять в середине полового цикла: с 8-го по 15— 16-й день. Препараты вводят однократно в дозе от 2 тыс. до 3 тыс. ИЕ. Через 48 ч после введения ГСЖК инъецируют простагландин Ф2 (ПГФ2) или один из его синтетических аналогов. Обычно через 2 дня наступает стадия возбуждения полового цикла с проявлением течки, общего возбуждения, охоты и овуляции. В этот период осеменяют животных-до- норов.

Преимуществом ГСЖК является их доступность (можно получать в необхо-димом количестве при наличии доста-точного числа беременных кобыл). Но они медленно инактивируются в организме, период полураспада гонадотропинов в организме коров составляет 6 дней, и их еще можно обнаружить в крови через 10 дней после введения. Гонадотропины после овуляции оказывают вредное влияние на качество развивающихся оплодотворенных яйцеклеток. При этом увеличивается возможность формирования фолликулярных кист яичников. Поэтому были предприняты попытки ограничить действие ГСЖК путем использования сыворотки, содержащей антитела. Антисыворотку к ГСЖК вводят донорам после суперову- ляторной обработки в начале проявления стадии возбуждения полового цикла, но результаты не всегда бывают надежными. Многие авторы считают, что благодаря введению антисыворотки у подопытных животных-доноров увеличивается количество овулирующих фолликулов по сравнению с контрольными животными, существенно уменьшается число фолликулов с кистозной дистрофией, а также наблюдается положительное влияние на оплодотворяемость овулирующих яйцеклеток.

С целью вызывания множественной овуляции можно применять препараты фолликулостимулирующего гормона (ФСГ). Они дают такую же эффективность, как ГСЖК, но их сложнее получать. Суперовуляцию можно вызывать ФСГ, получаемыми из гипофизов свиней и овец. Эти препараты имеют короткий период активности. Так, период полураспада ФСГ из гипофизов овец составляет 5 ч. По этой причине их назначают в снижающейся дозировке по 2 раза в день в течение 5 дней (первый и второй дни утром и вечером по 5 мг, третий день — соответственно по 4 мг, четвертый — по 3 мг и пятый — по 2 мг), всего Юдоз. Вводить ФСГ обычно начинают с 9-го по 11 -й день полового цикла. В ряде стран ФСГ используют в комбинации с лютеинизирующим гормоном (ЛГ) в соотношении 5:1 или в сочетании с простагландинами, которые инъецируют на третий день после начала обработки; в среднем через 48 ч после их введения животные-доноры проявляют стадию возбуждения полового цикла.

Ряд авторов сообщают, что после применения препаратов ФСГ получают больше зародышей, пригодных к пересадке, чем при использовании ГСЖК.

Некоторые авторы предлагают при ис-пользовании ФСГ упростить стандартную схему обработки и вместо двукратных проводить одноразовые инъекции в течение 5 дней. Этим достигается снижение затрат труда, уменьшение стрессорных влияний обработок на донора и повышается количество овуляций с 6,4 до 8,1.

При различных режимах обработки число овулировавших фолликулов у разных животных очень сильно варьирует. Это зависит от индивидуальных особенностей животных и многих других факторов. Описаны различия в чувствительности к ГСЖК у животных отдельных пород и линий крупного рогатого скота. При этом молочные породы проявляют меньшую реакцию, чем мясные. У телок наблюдается более высокая реакция, чем у коров.

Коровы-доноры должны всегда по-лучать полноценный рацион. Имеются четкие доказательства, что голодание коров-доноров в период после введения ГСЖК заметно уменьшает количество овуляций. Исследования с помощью ла-пароскопа показали, что множественная овуляция у коров и телок является длительным процессом и после обще-принятой обработки (ГСЖК, ФСГ + + ПГФ2) продолжается 24 ч и более. Если в одном яичнике происходит более 9—10 овуляций, то он настолько увели

чивается, что фимбрии яйцепровода не-способны его окружить и часть яйцеклеток может попасть в брюшную полость. Имеются предположения, что использование предварительного анализа ин-дивидуального гормонального фона у конкретных животных позволит лучше понять причины нарушений при супер- овуляторной реакции и, модифицируя гормональные обработки с учетом фи-зиологического состояния ■ животных, можно уменьшить вариабельность в ко-личестве овуляций и снизить число не-реагирующих животных.

ОСЕМЕНЕНИЕ ДОНОРОВ

Для их осеменения берут сперму вы-дающихся быков-производителей, про-веренных по качеству потомства и при-знанных улучшателями продуктивности. Имеются доказательства, что при ис-пользовании некоторых быков достигается более высокая степень оплодотворяемое™ коров-доноров, поэтому следует оценивать быков и по данному показателю. Отбор быков и работу со спермой проводят с соблюдением ветеринарно-санитарных правил и согласно действующей инструкции по искусственному осеменению коров и телок. После гормональной обработки доно-ров у них с помощью быков-пробников выявляют половую охоту не менее 2 раз в день. Примерно у 10—12% животных признаки стадии возбуждения полового цикла не проявляются. Осеменение жи-вотных, у которых обнаружена охота, проводят несколько раз с 12-часовыми интервалами до ее окончания, иногда его повторяют 3—4 раза. В каждой дозе спермы должно быть не менее 40— 50 млн живых подвижных спермиев. Чаще используют способ осеменения с ректальной фиксацией шейки матки, сперму вводят в ее канал.

Некоторые зарубежные авторы пред-лагают вводить сперму в полость тела матки. Имеются также рекомендации вводить одну порцию спермы в левый, а вторую — в правый рог матки. Свежие спермии сохраняют жизнеспособность в половых путях самок дольше, чем замо-роженные и оттаянные. Поэтому при ис-пользовании свежей спермы в течение охоты можно проводить 1—2 осеменения. При этом достигается более высокая степень оплодотворяемости. Нецелесообразно осеменять доноров в отдаленные сроки после окончания охоты, поскольку в дальнейшем это может оказывать вредное влияние на степень извлечения пригодных к пересадке зародышей.

ИЗВЛЕЧЕНИЕ ЗАРОДЫШЕЙ

Оплодотворение яйцеклеток происходит в яйцепроводе. Образовавшиеся зиготы подвергаются дроблению, и большинство из них у крупного рогатого скота попадают в матку на 4-й день. Зародыши целесообразно извлекать у коров на 7—8-й день, а у овец — на 5—6-й день после первого осеменения (до освобождения зародыша из прозрачной оболочки). Для извлечения зародышей используют два способа: нехирургический и хирургический.

При нехирургическом способе извлечения зародышей животных фиксируют в станке. Прямую кишку освобождают от содержимого и проводят тщательное ректальное исследование. Определяют, сколько желтых тел находится в каждом яичнике. Хвост с помощью тесемки фиксируют. Проводят туалет и дезинфекцию наружных половых органов и промежности. Для прекращения перистальтики прямой кишки эпидурально вводят 10 мл 2%-ного раствора новокаина. Для вымывания зародышей из матки приме-

/ г

Рис. 42. Катетер для извлечения зародышей:

1 — корпус катетера; 2 — мандрен; 3 — труба для нагнетания воздуха; 4— баллончик для воздуха

няют различные инструменты. Большинство авторов используют гибкий одноходовой катетер Фолея с упругим мандреном и надувным баллончиком (рис. 42). Инструмент должен быть стерильным. Сперва катетер вводят во влагалище по верхнему его своду и проводят под ректальным контролем через канал шейки матки в рог матки (рис. 43). Для более полного извлечения зародышей нужно, не травмируя слизистую оболочку, как можно глубже ввести инструмент в рог матки. После того как катетер достигнет в роге матки необходимого положения, мандрен удаляют и в баллончик катетера накачивают 10— 15 мл воздуха. При этом катетер фиксируется в роге матки и промывная жидкость не вытекает мимо катетера.

Закрепив катетер, промывают полость рога матки с помощью шприца

Рис. 43. Извлечение зародышей нехирургическим способом:

1 — катетер для извлечения зародышей; 2 — шейка и 3— рог матки; 4 — надувной баллончик; 5 — яичники

Люэра вместимостью 50—60 мл. В рог матки в зависимости от его величины вводят порциями от 40 до 60 мл промывной жидкости, затрачивая на промывание каждого рога не более 500 мл. Наполнение матки промывной средой и степень ее оттока контролируют рек- тально.

Для более полного извлечения заро-дышей верхушку рога матки приподнимают и выпрямляют. Некоторые авторы рекомендуют яйцепровод вблизи верхушки рога матки осторожно зажать большим и указательным пальцами. При этом предотвращается поступление в брюшную полость жидкости, содержащей зародыши. Однако практика показывает, что поступление в брюшную полость жидкости из рога матки отмечается только при наличии большого давления в матке, поэтому яйцепровод можно не зажимать. Перед извлечением катетера следует удалить воздух из баллончика. Таким же образом промывают и второй рог.

В качестве среды для промывания ис-пользуют фосфатно-буферный солевой раствор (ФБС) Дюльбекко (табл. 13).

Раствор готовят на тридистиллиро- ванной воде. Первые 4 вещества растворяют в 800 мл, а 5-е и 6-е — каждое отдельно в 100 мл. В итоге получают три раствора, которые автоклавируют, а затем смешивают. В таком виде их можно хранить при 4 °С до 2 нед. Непосредственно перед употреблением в ФБС вводят следующие компоненты (в расчете на 1 л):

альбумин бычьей сыворотки — 4 г;

глюкоза — 1 г (5,56 ммоль);

Na-пируват — 0,036 г (0,33 ммоль);

пенициллин (калиевая соль) — 100 тыс. ЕД.

Собранную в цилиндр промывную жидкость отстаивают 20—35 мин при температуре 20—37 °С, чтобы зародыши опустились на дно, после чего верхний слой удаляют с помощью сифона. Нижний слой жидкости порционно по 20— 30 мл для обнаружения зародышей ис-

Вещество г на 1 л ММОЛЬ Вещество г на I л ММОЛЬ

NaCl 8,00 136,87 кн2Р04 0,20 1,47

КС1 0,20 2,68 СаС12 • 2Н20 0,13 0,90

Na2HP04 • 12Н20 2,90 8,09 MgCl2 • 6Н20 0,10 0,49

следуют в больших часовых стеклах или чашках Петри под бинокулярной лупой при 10—50-кратном увеличении. Найденных зародышей с помощью пастеровской пипетки переносят в среду для кратковременного хранения (среда Дюльбекко с добавлением 20 % фетальной сыворотки теленка). После оценки зародышей их культивируют при 37 °С до момента пересадки или оставляют для хранения.

Хирургическим способом зародышей извлекают при общем или местном обезболивании. Разрезают брюшную стенку по белой линии или чаще в области голодной ямки справа или слева, подтягивают рог матки к поверхности раны, делают разрез вблизи его основания и вставляют специальный катетер. Затем через иглу, введенную в полость рога у его верхушки, или через канюлю, вставленную в яйцепровод, вводят специальную среду, которую вместе с зародышами собирают через катетер. При этом методе получают до 70 % жизнеспособных зародышей. У кролика, свиньи, овцы, коровы и кобылы можно извлекать зародышей непос-редственно из яйцепровода (в течение первых 4 дней после осеменения). Однако хирургический способ, по мнению многих специалистов, имеет лишь научное значение. Он трудоемок, требует больших расходов, и поэтому в настоящее время его применяют только у мелких животных (овец, коз и др.). После операции уживотного значительно снижается уровень молочной продуктивности, имеется риск потери высокоценного донора при общем обезболивании. Его нельзя часто повторять, так как в послеоперационный период образуются спайки, из-за чего возникают трудности в извлечении зародышей, а затем могут развиваться необратимые изменения, приводящие к бесплодию доноров.

ОТБОР РЕЦИПИЕНТОВ

Реципиент — животное, которому трансплантируют (пересаживают) в матку одного или двух зародышей на ранней стадии их развития. После пересадки в организме реципиента должны быть обеспечены оптимальные условия для дальнейшего развития зародыша и рождения жизнеспособного плода. Реципиентов отбирают в количестве 6—8 гол. на каждого донора из числа животных, не имеющих большой племенной ценности. При этом используют телок в возрасте 16—18 мес с массой 350—380 кг или коров не старше 7 лет. Животные должны быть здоровыми, без признаков нарушения обмена веществ. Успех пересадок в значительной степени зависит от физиологически полноценного течения половых циклов и правильного определения охоты у реципиентов. Необходимо тщательно контролировать течение последних двух половых циклов и все дальнейшие показатели регистрировать в соответствующей документации (календарь полового цикла). Половые циклы должны протекать регулярно, быть полноценными, с синхронным формированием стадии возбуждения. Животных с нерегулярными, неполноценными половыми циклами, с ненормальной продолжительностью отдель-ных феноменов стадии возбуждения полового цикла исключают из числа ре-ципиентов. Реципиенты должны быть в состоянии средней упитанности, с хорошим физическим развитием, иметь крупный, правильной формы таз. Яичники и матка должны быть нормально развиты, без патологических изменений.

Отобранных реципиентов еще раз обязательно обследуют перед транс-плантацией зародышей. Яичники должны быть типичными для соответствующей стадии полового цикла, без кист. Уточняют степень развития и положение желтого тела.

СИНХРОНИЗАЦИЯ ПОЛОВОГО ЦИКЛА РЕЦИПИЕНТОВ И ДОНОРОВ

При пересадке зародышей состояние всего организма и половой системы реципиента, в том числе состояние яичников, фаза дифференцировки эндометрия, должны соответствовать стадии развития зародышей. Только в этом случае последние попадают в условия, благоприятные для их приживления и развития. Если разница в сроках проявления полового цикла между донором и реципиентом составляет более 24 ч, то частота беременностей после пересадок резко снижается. Пересадку зародышей в производственных условиях лучше проводить при точной синхронности полового цикла у доноров и реципиентов. В случае неточного совпадения предпочтение отдается реципиентам, у которых охота проявилась несколько раньше, чем у доноров.

Результаты 2556 пересадок зародышей (Schneider и др., 1980) показали, что при точной синхронизации доноров и реципиентов беременность после пересадки развивалась у 67 % животных. Если охота у реципиента была на 12 ч раньше или позже, чем у донора, беременность устанавливали у 60—61 % реципиентов.

Пересадку зародышей реципиентам удавалось осуществить только до 16-го дня после выявления охоты. В более поздние сроки беременность не развивается, так как начинается обратное развитие желтого тела и в проводящих половых путях протекают процессы разрушения и обновления слизистых оболочек и подготовки их к очередной стадии возбуждения полового цикла. Аналогичные изменения проявляются во всем организме самки. Поэтому если имеется большое поголовье животных (200—400 реципиентов), то для осуще-ствления пересадок подбирают коров и телок, у которых стадия возбуждения полового цикла естественно наступила в те же сроки, что и у доноров. При небольшом количестве животных-реци- пиентов возникает необходимость в синхронизации полового цикла у реципиентов и доноров путем использования простагландинов и гестагенов. Через 2—3 дня после применения этих препаратов коровы и телки приходят в охоту. Необходимо учитывать, что про-явление начала стадии возбуждения по-лового цикла у отдельных животных различное, поэтому в каждом случае для своевременного и полного выявления охоты нужно проводить тщательные наблюдения с использованием самцов- пробников. Несвоевременное выявление животных в охоте снижает процент развития беременности после пересадки зародышей.

При использовании замороженных зародышей нет необходимости в синх-ронизации полового цикла реципиентов и доноров. В этом случае зародышей можно пересаживать в сроки, когда у реципиентов естественно наступят соответствующие дни полового цикла.

ПЕРЕСАДКА ЗАРОДЫШЕЙ РЕЦИПИЕНТАМ

Пересадку зародышей осуществляют хирургическим и нехирургическим спо-собами. Непосредственно перед пересадкой еще раз обследуют состояние здоровья и половой системы реципиентов, выявляют, в каком яичнике находится желтое тело, соответствуют ли его величина и консистенция срокам полового цикла. Наилучшим местом пересадки считают верхушку рога матки, прилегающего к яичнику с желтым телом.

Хирургический способ пересадки зародышей. Чаще применяют на телках. Можно использовать оперативный доступ с разрезом по белой линии живота. Подготовка и техника операции такие же, как при извлечении зародышей. Рог матки подтягивают к разрезу, его стенку перфорируют тупой иглой в участке с наименьшим количеством сосудов, примерно в 4 см от верхушки рога. Затем через маленькую ранку с помощью пас-теровской пипетки в небольшом количестве среды для культивирования вводят зародыш в направлении верхушки рога. После этого зашивают брюшную стенку по всем правилам хирургической операции.

Более удобным, практичным и быстрым является хирургический способ пересадки зародыша с разрезом брюшной стенки в области голодной ямки. Оперируют животных в стоячем положении с использованием успокаивающих средств и местного обезболивания. Разрез должен быть расположен как можно дальше в каудальном направлении. Верхушку рога матки подводят к разрезу, удерживая пальцами за широкую маточную связку. Зародыш пересаживают по направлению к верхушке рога матки, как при операции по белой линии живота; приживляется до 85 % зародышей.

Нехирургический способ пересадки зародышей. Более пригоден для ис-пользования его в производственных условиях. Для этого применяют различные катетеры (рис. 44). Часто используют прибор для искусственного осеменения Касу в модифицированной форме с длиной трубки 50 см и наружным диаметром 2,5 мм. Зародыш подготавливают к пересадке в стерильной тонкой трубочке диаметром 1 мм и объемом 0,25 мл. Присоединив шприц к трубочке со стороны фильтра, набирают столбик среды для культивирования (высотой 1 см), затем такой же столбик воздуха и среду с зародышем (контролируя под бинокулярной лупой). После этого вновь набирают столбик воздуха и среду для культивирования. Набранная в трубочку среда достигает фильтра с поливиниловым спиртом; фильтр набухает и больше не пропускает воздух, поэтому из пластиковой соломинки ничего не вытекает. Подготовленную трубочку с зародышем вставляют в стерильный прибор для пересадки. Чтобы предотвратить инфицирование прибора при пересадке, на него почти во всю длину надевают пластиковую оболочку.

Реципиентов к пересадке зародышей подготавливают так же, как и доноров при нехирургическом извлечении. Для уменьшения сокращений матки, снижения возможности повреждения эндометрия применяют маточный релаксант.

Прибор вводят во влагалище и при достижении шейки матки снимают тонкую оболочку. После этого прибор продвигают под ректальным контролем через канал шейки матки и далее в рог матки ближе к его верхушке (примерно на глубину 10 см) (рис. 45). Затем содержимое из трубочки выталкивают движением внутреннего поршня и прибор быстро, но осторожно извлекают из матки. Приживаемость зародышей составляет 50%.

После подсадки животным создают условия кормления и содержания в со-ответствии с зоогигиеническими требо-ваниями, не допускают травмирования и сильных отрицательных стрессовых воздействий. Организуют раннюю реф-лексологическую диагностику беремен-ности, что исключает возможность пропуска повторной охоты. Через 2 мес после пересадки проводят диагностик