Химический состав плазмы спермы собак (White L. G., 1980)
| Фракция спермы | Объем фракции, мл | рН | Натрии, мг% | Калий, мг% | Кальций, мг% | Магний, мг% | Хлор, мг% | Фруктоза, мг% | Сорбит, мг% | Лимонная кислота, мг% | Глицерил-фосфорил-холин, мг% | Протеин, г% |
| Вторая | 1...5 | 6,3 | Следы отсутствуют | 3,7 | ||||||||
| Третья | 5...20 | 6,8 | 2,8 |
Плазма спермы собак содержит мало энергетических материалов (фруктозы, сорбита), лимонной и аскорбиновой кислот. Основной катион плазмы спермы – натрий, анион – хлор. Плазма характеризуется высокой электропроводностью и низкой буферной емкостью (поэтому не способна эффективно противостоять неблагоприятным воздействиям на спермии многих внешних факторов).
Спермии – главный компонент спермы – вырабатываются в извитых канальцах семенников. Тестикулярные спермии представляют собой незрелые мужские половые клетки, которые созревают и хранятся в канале придатка семенника. Зрелые спермии практически лишены цитоплазмы, незрелые содержат проксимальную или дистальную цитоплазматическую каплю.
Зрелые спермии состоят из головки, шейки, тела и хвоста (рис. 12). Головка спермия ложкообразная: спереди имеет форму овала, сбоку – узкой полоски, вогнутой с одной стороны и выпуклой с другой. Длина головки достигает 6,1х10–3мм, ширина – 3,8х10–3 мм, толщина – примерно 1 х 10–3 мм. Общая длина спермия составляет 6,14х10–2 мм (Mahi–Brown С. А., 1991).
Рис. 12. Схематическое изображение спермия собаки:
1 – головка; 2 – шейка; 3 – тело; 4 – хвост
Оплодотворение яйцеклетки – основная функция спермия, выполнение которой обеспечивается за счет способности спермиев активно двигаться, генерировать энергию и проникать через оболочки ооцита. Оплодотворяющей способностью характеризуется головка спермия. Большую часть головки занимает ядро, окруженное непроницаемой ядерной оболочкой. Хроматин ядра плотно упакован и состоит из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и специфических ядерных белков – гистонов. Снаружи головка покрыта цитоплазматической оболочкой (плазмолеммой), которая переходит на шейку, тело и хвост спермия. В апикальной части головки спермия между плазмолеммой и ядерной оболочкой располагается акросома, состоящая из внутренней и внешней мембран и содержимого, богатого ферментами. Акросомные энзимы необходимы для рассеивания клеток яйценосного бугорка и проникновения головки спермия в яйцеклетку. Ферменты из акросомы высвобождаются после дозревания спермиев в нижней трети маточных труб в результате так называемой акросомной реакции – разрушения наружной оболочки акросомы.
Шейка соединяет головку с телом. Ее цитоплазма содержит две центриоли – проксимальную, которая при оплодотворении вносится в цитоплазму яйцеклетки, и дистальную, которая подразделяется на две части: переднюю и заднюю. От передней части дистальной центриоли начинается осевая нить – двигательный аппарат спермия, представляющий собой микротрубочки, содержащие сократительный белок тубулин. Осевая нить состоит из 11 фибрилл, 2 из которых центральные, 9 боковые. Боковые фибриллы, сформированные из тонких внутренних и толстых наружных нитей, образуют фибриллярный футляр. Осевая нить пронизывает тело и хвост спермия и по строению сходна с ресничками мерцательного эпителия. Энергию, необходимую для движения спермия, генерируют митохондрии, образующие двойную спиралевидную оболочку вокруг осевой нити тела. Замыкающее кольцо этой оболочки (кольцо Иенсена) представляет собой заднюю часть дистальной центриоли.
Хвост – орган движения спермия. Его осевая нить окружена тройной спиральной нитью. Концевая часть хвоста лишена плазмолеммы, из-за расслоения 11 тонких фибрилл по виду напоминает кисточку.
Источником энергии для спермиев служит аденозинтрифосфорная кислота (АТФ). Эндогенные запасы АТФ у спермия быстро расходуются при движении и поэтому должны постоянно восполняться за счет гликолиза (фруктолиза) моносахаров и биологического окисления различных веществ. При гликолизе образуются две молекулы молочной кислоты и выделяется энергия: С6Н12O6 –> 2СзН6О3 + 2АТФ. Химически процесс окисления глюкозы (фруктозы) выражается следующей формулой: С6Н12O6+ 602 –> 6СO2 + 6Н2О + 38АТФ. В качестве энергетических материалов спермии могут использовать фруктозу и сорбит плазмы спермы, собственные структурные жиры и белки, а в половых путях самки и в искусственных средах – фруктозу, глюкозу, маннозу и некоторые другие соединения. Конечные продукты окисления жиров – диоксид углерода и вода. При окислении белков могут образовываться токсичные для спермиев вещества: аммиак, пероксид водорода.
Различают три вида движения спермиев: прямолинейно-поступательное, колебательное и манежное. Нормальные спермии двигаются прямолинейно-поступательно за счет волнообразных сокращений хвоста и вращения спермия вокруг своей оси. При недостаточном количестве энергии спермии совершают только колебательное движение, при деформированной головке – двигаются по кругу: как бы гоняются за своим хвостом. Спермии способны к ориентированному движению: против тока жидкости (реотаксис) и по направлению к химическим раздражителям (хемотаксис). При движении они не сталкиваются и не склеиваются друг с другом благодаря поверхностному отрицательному электрическому заряду.
Влияние факторов внешней среды на активность и жизнеспособность спермиев. При работе со спермой вне организма необходимо четко представлять характер воздействия факторов внешней среды на активность и жизнеспособность спермиев и умело использовать эти знания на практике.
Температура. При нормальной температуре тела животного спермии проявляют высокую метаболическую и двигательную активность, но быстро погибают вследствие истощения энергетических запасов и накопления в плазме спермы продуктов обмена (молочной кислоты и др.). Повышение температуры опасно для спермиев. При температуре 46 °С и выше начинается коагуляция (свертывание) белков плазмы. Охлаждение спермы улучшает ее сохранность. При температуре 15 °С спермии становятся малоактивными и способны совершать только колебательные движения. При температуре 2...5 °С они впадают в состояние анабиоза. При нагревании охлажденной спермы до нормальной температуры тела животного их активность восстанавливается. Однако следует отметить, что резкое охлаждение спермы вызывает температурный (холодовый) шок – гибель и повреждение спермиев. При разбавлении спермы молочным разбавителем или специальными протекторными (защитными) искусственными средами, содержащими свежий желток куриного яйца, и при медленном охлаждении спермии не погибают от температурного шока. В естественной среде – плазме спермы – спермии не переносят замораживания. При разбавлении спермы криопротекторной искусственной средой, содержащей глицерин, и соблюдении технологии замораживания большинство спермиев после размораживания сохраняет свою активность и оплодотворяющую способность. Срок хранения замороженной спермы исчисляется десятилетиями.
Свет. Прямой солнечный свет вреден для спермиев. Под его воздействием в плазме спермы в результате фотохимических реакций образуется токсичное для спермиев вещество – пероксид водорода. В отличие от крови плазма спермы не содержит пероксидазы – фермента, разрушающего пероксид водорода.
Реакция, или рН, среды. Концентрация ионов водорода оказывает большое влияние на подвижность и жизнеспособность спермиев. Слабокислая среда подавляет обменные процессы в спермиях, слабощелочная, наоборот, активизирует обмен веществ в половых клетках. В слабокислой среде спермии впадают в состояние анабиоза уже при комнатной температуре. Нейтрализация кислоты, а также повышение температуры выводят спермии из анабиотического состояния, и они возобновляют движение. Сильные кислоты и щелочи даже в незначительных концентрациях вызывают гибель спермиев.
Осмотическое давление. Спермии очень чувствительны к изменениям осмотического давления среды, в которой они находятся. Осмотическое давление создается растворенными в воде веществами и зависит от их концентрации. Растворы, осмотическое давление которых такое же, как у спермы, называют изотоническими, меньшее – гипотоническими, большее – гипертоническими. Гипо- и гипертонические среды вызывают гибель спермиев. В гипотонических растворах спермии погибают от набухания, в гипертонических – от обезвоживания. Спермии хорошо сохраняют свою жизнеспособность в изотонических растворах многих солей и сахаров: 0,9%-м растворе хлорида натрия, 2,9%-м цитрата натрия, 1%-м бикарбоната натрия, 6%-м глюкозы и др.
Препараты, используемые при искусственном осеменении. По безвредности их подразделяют на абсолютно безвредные (глюкоза, цитрат натрия и др.), безвредные (лактоза и др.), относительно безвредные (хлорид натрия, бикарбонат натрия и Др.), условно безвредные (трисбуфер, глицерин, антибиотики и др.) и вредные (спирт, пероксид водорода и др.). В практике искусственного осеменения используют вещества, относящиеся к первым четырем группам. Абсолютно безвредные, безвредные и относительно безвредные препараты можно использовать в изотонических концентрациях, условно безвредные вводят в состав сложных искусственных сред в небольших количествах, чтобы повысить устойчивость спермиев к действию различных внешних факторов – замораживанию, контаминации микроорганизмами и др.
Оценка эякулята. Сперму получают только от здоровых, физиологически зрелых самцов в манеже с соблюдением ветеринарно-санитарных правил и не более 3 раз в неделю. При таком режиме можно получать до 2 млрд спермиев в неделю. Более интенсивное использование самцов-производителей приводит к их половому истощению и ухудшает качество получаемой спермы. Для хранения спермы в замороженном состоянии от собак обычно получают 2 эякулята с перерывом в 1...2 ч (в неделю).
Качество спермы оценивают сразу же после ее получения. Сперму исследуют макро- и микроскопически. При макроскопическом исследовании определяют ее объем, цвет, запах и консистенцию; при микроскопическом – активность спермиев, их концентрацию, процентное соотношение нормальных и патологических форм.
В норме сперма собак консистенции и цвета обезжиренного молока, без запаха. Сперму с неприятным запахом, загрязненную кровью (гемоспермия), мочой (уриноспермия), гноем (пиоспермия) выбраковывают. При выделении такой спермы самца-производителя тщательно обследуют, назначают соответствующее лечение и не допускают к использованию до полного выздоровления.
Активность спермиев определяют под микроскопом при температуре 38...39 «С, используя специальный обогревательный столик. На чистое предметное стекло наносят каплю спермы и накрывают покровным стеклом. Раздавленную каплю исследуют под микроскопом в неярком свете при увеличении 200...300 раз. Сперму оценивают визуально по десятибалльной шкале, определяя количество спермиев с прямолинейно-поступательным движением. Высшую оценку 10 баллов получает сперма, в которой практически все спермии двигаются прямолинейно-поступательно. При оценке 9 баллов примерно 90% спермиев двигаются прямолинейно-поступательно, при оценке 5 баллов – 50% и т. д. Сперму, не содержащую спермиев, обозначают буквой А (аспермия), с мертвыми спермиями – буквой Н (некроспермия). Нормальная активность спермиев собаки составляет 7...10 баллов.
Концентрация спермы – показатель, который определяют при помощи счетной камеры Горяева, используемой для подсчета эритроцитов и лейкоцитов (наиболее простой и достаточно надежный способ), а также при помощи фотоэлектрического колориметра или автоматического счетчика клеток. Камера Горяева состоит из толстого предметного стекла, разделенного поперечными прорезями на три площадки. Средняя площадка ниже боковых на 1/10 мм и разделена продольной прорезью на две части, на каждой из которых выгравирована сетка. Каждая сетка состоит из 225 больших квадратов, из них 25 разделено на 16 маленьких квадратиков. Площадь маленького квадратика составляет 1/400 мм2. Если площадку накрыть шлифованным стеклом, то объем камеры маленького квадратика составит 1/400 мм3.
Для подсчета спермиев пробу спермы предварительно разбавляют 3%-м раствором хлорида натрия. В гипертоническом растворе хлорида натрия спермии становятся неподвижными (погибают), что облегчает подсчет. Сперму разбавляют в 100 раз при помощи эритроцитарного меланжера. Для этого в меланжер вначале набирают сперму до отметки 1, затем раствор хлорида натрия до отметки 101. Чтобы равномерно смешать сперму с раствором, концы меланжера зажимают между большим и указательным пальцами и встряхивают в течение 2...3 мин. Из пипетки меланжера удаляют первые 4 капли, не содержащие спермиев. Следующую каплю вносят под заранее притертое шлифованное стекло. Заряженную камеру Горяева кладут на столик микроскопа и исследуют под большим увеличением. Спермии подсчитывают в пяти больших квадратах (80 малых) по диагонали. Считают только головки спермиев, расположенные внутри малых квадратиков, а также на их левых и верхних линиях. Число спермиев, подсчитанных в пяти больших квадратах, суммируют и делят на 200. При делении получается цифра, выражающая содержание спермиев (млрд в мл).
Концентрация спермы собак может сильно варьировать – от 25 млн до 400 млн клеток в 1 мл. По этой причине качество спермы оценивают не по ее концентрации, а по числу активных спермиев в эякуляте.
Ценным показателем служит процентное соотношение нормальных и патологических форм спермиев. Чтобы определить их соотношения, наносят на край обезжиренного, сухого, чистого и теплого предметного стекла 1 каплю спермы и 2...3 капли 0,9%-го раствора хлорида натрия. Капли быстро перемешивают стеклянной палочкой и делают при помощи шлифованного стекла тонкий мазок. Мазок высушивают, фиксируют несколько минут 96%-м спиртом и окрашивают не менее 5 мин 1...2%-м раствором эозина. Раствор краски готовят на 2,9%-м растворе цитрата натрия. Краску на стекле смывают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Просохший мазок просматривают под микроскопом при увеличении в 400...600 раз и подсчитывают в нескольких полях зрения не менее 200 спермиев. Число нормальных и патологических форм спермиев по каждому полю зрения суммируют и определяют их процентное соотношение.
К патологическим формам спермиев относят: гигантские, карликовые, с деформацией головки, с двумя головками, с надломом шейки и ее эксцентричным креплением к головке, изолированные головки, с искривленным и закрученным хвостом, с двумя хвостами, с цитоплазматической каплей и т. д.
В нормальной сперме собак удельный вес патологических форм спермиев не должен превышать 30%.
Хранение спермы. Собак осеменяют свежеполученной, охлажденной (сохраняемой при температуре 2...5 °С) и заморожено-оттаянной спермой.
Свежеполученную сперму используют сразу же после оценки ее качества. К использованию допускают эякуляты, содержащие не менее 60 млн активных спермиев. Наилучшие результаты получают при содержании в спермодозе не менее 200 млн активных спермиев.
Охлаждение – наиболее отработанный способ хранения спермы вне организма. Для разбавления и кратковременного хранения спермы собаки обычно используют молочную и цитратно-желточную среды.
Молочная среда. Свежее цельное или лучше обезжиренное коровье молоко – 100 мл, пенициллин и (или) стрептомицин – 0,05...0,1 г.
Молоко берут от клинически здоровых коров с отрицательными результатами исследований на туберкулез, лептоспироз, бруцеллез, а также мастит. Желательно подобрать коров, продуцирующих молоко низкой жирности, поскольку молочные жировые шарики значительно затрудняют оценку качества разбавленной спермы. Молоко обязательно прогревают на водяной бане в течение 10 мин при температуре 92...96 °С для разрушения некоторых его белков, оказывающих на спермии токсическое действие. Затем молоко процеживают через 3...4 слоя стерильной марли, охлаждают до температуры 35...39 °С и добавляют антибактериальный препарат.
Цитратно – желточная среда. Цитрат натрия трех-замещенный пятиводный – 2,32 г, свежий желток куриного яйца – 20 мл, пенициллин и (или) стрептомицин – 0,05...0,1 г, вода дистиллированная (бидистиллированная) – 80 мл.
Навеску цитрата натрия вносят в чистую стерильную колбу. Вливают в колбу прокипяченную и остуженную дистиллированную воду; фильтруют, добавляют антисептик и желток куриного яйца. Перед извлечением желтка скорлупу яйца обеззараживают при помощи бактерицидной лампы или спиртового ватного тампона.
Среды готовят непосредственно перед получением спермы. Последнюю разбавляют сразу же после оценки ее качества. Температура спермы и среды должна быть одинаковой, чтобы предупредить температурный шок спермиев. Разбавляют сперму в градуированном смесителе, при этом среду добавляют небольшими порциями. После добавления каждой порции смеситель вращают, чтобы равномерно смешать среду и сперму. Разбавленную сперму медленно охлаждают и хранят при температуре 2...5 °С до 4...5 сут. В 1-е сутки хранения оплодотворяющая способность охлажденной спермы соответствует свежеполученной, на 4-е сутки она лучше, чем заморожено-оттаянной.
Криоконсервация, или замораживание, – самый перспективный способ хранения спермы вне организма. Впервые собаку успешно осеменили заморожено-оттаянной спермой в 1969 г. в США.
Методические основы замораживания и хранения спермы собаки и быка одинаковы. Сперму разбавляют в 4...9 раз криопротекторной средой (до концентрации не менее 40...80 млн активных спермиев в 1 мл). В качестве криопротекторной среды обычно используют трисбуферный разбавитель, содержащий 20% желтка куриного яйца, 4...16% глицерина, или же лактозо(11%) – желточно(20%) – глицериновую (4...16%) среду. Сперму замораживают в ампулах объемом 1 мл, соломинках (пайеттах) объемом 0,5...! мл или гранулах; в парах жидкого азота или на блоках твердого диоксида углерода (–79 °С) и хранят в жидком азоте (–196 °С).
Сперму размораживают на водяной бане (при температуре 38...40 °С) в течение 30 с. Активность размороженной спермы собак обычно составляет 6...7 баллов. Сперму активностью ниже 4 баллов не используют.
Результативность осеменения собак заморожено-оттаянной спермой оставляет желать лучшего, и поэтому криоконсервирование спермы собак практикуют редко. По данным Американского клуба собаководов, в период с 1981 по 1991 г. от самок, осемененных заморожено-оттаянной спермой, получили всего 240 пометов.
Способы искусственного осеменения. Самок осеменяют на 10-е и 12-е сутки после начала течки (проэструса), на 4-е и 6-е сутки половой охоты или же на 2-е и 4-е сутки после проявления преовуляторного пика ЛГ.
Как известно, продолжительность проэструса у собак может сильно варьировать, по этой причине правильно выбрать время осеменения, ориентируясь на дату начала течки, удается далеко не всегда. Из-за вариабельности овуляции нельзя быть уверенным в точности выбора и при ориентации на дату начала половой охоты. Наиболее правильно оптимальное время осеменения собак можно выбрать по дате проявления преовуляторного пика ЛГ, используя прямые и непрямые методы его определения (картина влагалищных мазков, многократные измерения концентрации прогестерона или же ЛГ в крови).
Разработано два способа искусственного осеменения собак – влагалищный и маточный.
Влагалищный способ на сегодняшний день остается основным. Самку удерживают в стоячем положении. Половые органы ее обмывают теплой водой и орошают 1%-м раствором бикарбоната натрия. По верхнему своду преддверия влагалища и влагалища вводят укороченный стерильный полистироловый катетер для осеменения коров цервикальным способом с ректальной фиксацией шейки матки. Продвижение катетера к цервикальному каналу контролируют рукой через брюшную стенку. С помощью резиновой трубочки к катетеру присоединяют стерильный одноразовый шприц со спермой. Заднюю часть тела собаки поднимают на левое бедро осеменатора, сидящего на стуле. Собаку удерживают в наклонном положении: спереди за ошейник – владелец, сзади – осеменатор. Левой рукой осеменатор удерживает самку за левое бедро, правой медленно вводит сперму из шприца во влагалище. Катетер извлекают, в преддверие и каудальную часть влагалища вводят на 10 мин большой палец для имитации «полового замка» и стимуляции антиперистальтических сокращений в матке. Наклонное положение самки при введенном в ее влагалище пальце способствует быстрому проникновению спермы в матку. По материалам японских исследователей (Tsuitsui Т. et al., 1989), уже через 2,5 мин после введения спермы в краниальную часть влагалища спермии оказываются в полости верхушки рогов матки. После осеменения собаку выгуливают 30 мин, не позволяя ей бегать, прыгать и садиться. Хорошие результаты получают при осеменении собак свежеполученной спермой. Эффективность осеменения заморожено-оттаянной спермой остается очень низкой, охлажденной – зависит от срока ее хранения.
Внутриматочный способ практикуют редко. Этот метод разработан, чтобы повысить эффективность осеменения заморожено-оттаянной спермой. В литературе описаны два нехирургических и два хирургических способа внутриматочного осеменения собак.
Нехирургический внутриматочный способ осеменения собак с помощью норвежского катетера, применяемого для осеменения лисиц, разработан в Швеции. Используют: металлический катетер длиной 20...50 см, диаметром 0,5...1мм, нейлоновую протекторную оболочку, одноразовый шприц на 2 мл.
Металлический катетер в нейлоновой протекторной оболочке вводят по верхнему своду влагалища в его краниальную часть. С помощью большого и указательного пальцев захватывают шейку матки и контролируют продвижение катетера до входа в цервикальный канал. Металлический катетер выдвигают из защитной оболочки. Осторожно манипулируя катетером и шейкой матки, отыскивают вход в канал шейки матки. Цервикальный канал проходят, вращая катетер и оттягивая шейку матки назад. Длина канала шейки матки составляет всего 0,5...1 см. Сперму вводят, удостоверившись, что кончик катетера находится в теле матки. Катетер извлекают. Самке придают наклонное положение и удерживают в нем в течение 10 мин, введя во влагалище большой палец.
Недостатки способа: неприемлем для нервных и тучных собак; связан с риском травмирования и инфицирования половых органов самки; технически трудновыполним – необходимы специальная подготовка и постоянная практика. Опытный ветеринарный врач на отыскание шейки матки и введение катетера в полость тела матки затрачивает около 1 мин.
Нехирургический внутриматочный способ осеменения при помощи эндоскопа разработан в США. Используют: цистоэндоскоп диаметром 3 мм, длиной 30 см для визуализации шейки матки, пластиковый катетер для катетеризации мочевого пузыря у самцов или ангиографический катетер диаметром 3 мм.
Преимущества использования эндоскопа: инструмент для осеменения вводят в цервикальный канал под визуальным контролем, заметно снижен риск травмирования и инфицирования половых органов.
Недостатки способа: неприемлем для нервных самок и самок с длинным влагалищем; процедура внутриматочного осеменения очень сложна и трудоемка, связана с применением дорогих инструментов и необходимостью специальной предварительной подготовки.
Хирургический внутриматочный способ осеменения через разрез брюшной стенки заключается в следующем. Самок выдерживают на голодной диете 18...24 ч. Под общим наркозом фиксируют на столе в спинном положении. Крышку операционного стола переводят в наклонное положение, чтобы вызвать смещение внутренних органов вперед и облегчить процедуру обнаружения рогов матки в брюшной полости. С соблюдением правил асептики и антисептики подготавливают операционное поле и делают разрез по белой линии живота. Извлекают рога матки. При помощи шприца с иголкой в их полость вводят сперму. Брюшную стенку зашивают обычным способом.
Процедура осеменения этим способом очень проста, но трудоемка, связана с использованием общего наркоза и возможна только в условиях клиники.
Хирургический внутриматочный способ осеменения с помощью лапароскопа и специальной пипетки с игольчатым наконечником разработан в Японии (Tsuitsui Т. et al., 1989) и подробно описан (Silva L. D. М. et al., 1994). Самку выдерживают на голодной диете. Под общим наркозом фиксируют на операционном столе в наклонно-спинном положении. Вентральную поверхность живота выбривают, обрабатывают антисептиками. При помощи иглы в брюшную полость накачивают диоксид углерода. Отступив от пупка 1 см назад по белой линии, при помощи троакара сначала в брюшную полость вводят световод диаметром 8 мм, соединенный с камерой лапароскопа, и отыскивают рога матки, затем на правой стороне живота, отступив 2 см в сторону от заднебрюшной молочной железы, вводят второй троакар диаметром 5 мм. Эндоскопическими щипцами, введенными в брюшную полость через канюлю троакара, захватывают тело матки и подтягивают к вентральной поверхности брюшной стенки. Брюшную стенку и рог матки прокалывают иглой, через которую вводят внутриматочный катетер. Иглу извлекают и через катетер осеменяют самку.
Недостатки способа: очень сложен, трудоемок, связан с использованием дорогостоящей аппаратуры, малопригоден для производственного применения. При проколе брюшной стенки существует риск повреждения крупных сосудов и внутренних органов.
Глава 3