Приготовление гистологического препарата

1. По характеру взятого материала различают следующие виды гистологических препаратов: а) срезы органов (толщиной 5-15 нм), б) мазки (крови, костного мозга и т.д.), в) плёнки (брюшины, мягкой мозговой оболочки), или тотальные препараты Чаще всего используются срезы. 2. Приготовление препарата обычно включает 4 следующих этапа: а) взятие и фиксация материала, б) обезвоживание и уплотнение материала, в) приготовление срезов, в) окрашивание препаратов и заключение в консервирующую среду.

Взятие и фиксация материала

1. Из соответствующего органа вырезают небольшие кусочки (0,5 x 1 x 1 см) и погружают их в фиксатор (формалин, метанол и т.д.) - обычно на 24 ч. 2. Фиксация производится для предупреждения процессов аутолиза (самопереваривания) тканей. Это достигается путём денатурации (коагуляции) белков. 3. После фиксации образцы промывают проточной водой в течение нескольких часов.

Обезвоживание и уплотнение материала

1. Затем образцы уплотняют - чтобы в последующем их можно было резать на микротоме. Часто в качестве уплотнителя используют парафин или целлоидин. 2. Предварительно образцы обезвоживают (иначе гидрофобный уплотнитель не сможет проникнуть в ткань). а) Для этого их “проводят” по батарее спиртов - 70 % , 80 % , 96 % , 100 % этанол - по 24 часа в каждом спирте. б) Т.к. парафин не растворим и в этаноле, образцы выдерживают потом в смеси этанол-ксилол и в чистом ксилоле. 3. а) Заливка: помещают образцы в смесь ксилол-парафин и затем в жидкий парафин на 1-2 ч при 52-56 о С. б) Дают парафину, остывая, затвердеть; вырезают из него блок с заключённым образцом и закрепляют на деревянном кубике.

Приготовление срезов

1. Кубики вставляют в специальный прибор - микротом, - служащий для приготовления срезов. 2. а) С помощью микрометрической механической системы объектодержатель вместе с кубиком перемещается за каждый шаг на определённое расстояние (напр., 10 мкм). б) А микротомный нож, направляемый под углом к поверхности парафинового блока, срезает с него тонкой слой органа (срез) заданной толщины. 3. Срезы помещают на поверхность тёплой воды для их расправления, а затем - на предметное стекло.

1.1.2.4. Окрашивание препаратов и заключение в консервирующую среду

1. Перед окрашиванием образцы освобождают от парафина, проводя по батарее растворителей: ксилол, спирт 100 %, 96 %, 80 %, 70 %, 60 %, вода (по 2-5 мин) (Этот ряд кончается водой в том случае, если затем используется водорастворимый краситель.) 2. Для окрашивания предметные стёкла со срезами помещают на короткое время в раствор красителя, промывают водой, обрабатывают раствором другого красителя (если таковой используется тоже) и вновь промывают водой. 3. Препарат опять обезвоживают (проводя по батарее спиртов с возрастающей концентрацией), а затем просветляют (в карбол-ксилоле и ксилоле) - для удаления лишней краски. 4. Наконец, на препарат наносят каплю канадского бальзама (в случае среза) или кедрового масла (на мазки крови) и накрывают покровным стеклом.

Таким образом, приготовление гистологического препарата - весьма долгая и
трудоёмкая процедура.
Но при правильном её выполнении полученный препарат может храниться неопределённо долгое время.

Методы окрашивания гистологических препаратов

Типы красителей

Все красители, используемые в гистологической технике, подразделяются на 3 типа.-

Тип красителя	Пример	Окрашиваемые структуры
Кислые красители	Кислоты и кислые соли : эозин (искусственная краска; название - от греч. эос - заря); кислый фуксин.	а) Окрашиваемые структуры называются оксифильными (имеющими сродство к кислым красителям). б) Это белковые компоненты цитоплазмы и неклеточные структуры (коллагеновые волокна).
Основные красители	Основные соли : гематоксилин (точнее, продукт его окисления - гематеин); азур 2, кармин.	а) Красящиеся структуры - базофильные (сродство к основным красителям). б) Это структуры, богатые нуклеиновыми или иными кислотами - ядра, рибосомы, аморфный компонент межклеточного вещества.
Нейтральные красители	Смесь двух красителей: основного (азур 2) и кислого (эозин).	а) Структуры, воспринимающие кислые красители, окрасятся эозином; пример - специфические гранулы в эозинофильных лейкоцитах. б) Ядра всех клеток окрашиваются азуром 2.
Индифферентные красители	Судан III, судан IV	Суданом окрашиваются жировые капли (в которых он растворяется).

Существует большое количество различных способов окраски.
Те из них, которые встречаются в нашем курсе, перечислены ниже.

Общие методы окраски

1. Окраска гематоксилин -эозином	1.а) Самый распространённый метод окраски. б) Сочетает основной и кислый красители. в) Поэтому позволяет выявить почти все клетки и многие неклеточные структуры. 2. а) Ядра приобретают сине-фиолетовый цвет, б) цитоплазма -желтовато-розовыйцвет. 3. Замечание: используемый гематоксилин готовится по методу Эрлиха: окисляется до гематеина калийными квасцами.
2. Окраска железным гематоксилином(по методу Генденгайна)	1. Препарат предварительно обрабатывают (протравляют) железноаммиачными квасцами, а потом обрабатывают гематоксилином. 2. Структуры приобретают коричневато-серый цвет. 3. Хорошо выявляются структуры ядра, границы клеток, мышечные волокна.