Практические навыки получаемые на кафедре гистологии

Практические навыки получаемые на кафедре гистологии

Техника микроскопирования с разными объективами: х8, х40, х90.

Чтение гистологических препаратов

Техника гистологического рисунка

Освоение техники гистологического окрашивания гематоксилин – эозином

Анализ электроннограмм и граф-логических структур.

Диагностика гистологических структур на микропрепаратах

Техника чтения мазка периферической крови человека и подсчета лейкоцитарной формулы.

Составление протокола изучаемого гистологического препарата.

Профилизация

Студентам стоматологического факультета дифференцировка на микропрепаратах тканей, составляющих зуб.

Студентам педиатрического факультета: диагностика мазка периферической крови ребенка разных возрастных групп.

Правила работы с микроскопом

1. Поставить микроскоп в удобное для работы положение и выбрать источник освещения

2. Привести микровинт в рабочее положение- точка на левой стороне штатива должна находится по середине между двумя рисками

3. Поставить объектив малого увеличения на 8 в центральное положение, вращая револьвер по часовой стрелке.

4. Добиться равномерного освещения верхней линзы конденсора, пользуясь вогнутым зеркалом.

5. Проверить равномерность освещения поля зрения через окуляр микроскопа.

6. Поместить препарат покровным стеклом кверху на предметный столик микроскопа

7. Установить объектив малого увеличения на расстоянии 0,8-1,0 см. от препарата, работая микровинтом. Под контролем глаза добиться четкости изображения

8. Установить объектив большого увеличения на 40 в центральное положение, вращая револьвер по часовой стрелке

9. Добиться четкости изображения, работая микровинтом (2-5 оборотов), в направлении чаще всего на себя, реже от себя.

10. Когда работа будет выполнена перевести револьвер в нерабочее положение и убрать препарат.

Чтение гистологического препарата

Освоение техники гистологического окрашивания гематоксилин эозином

Световая микроскопия

1.1.1. Устройство микроскопа
1.1.2. Приготовление гистологического препарата

1.1.2.1. Взятие и фиксация материала
1.1.2.2. Обезвоживание и уплотнение материала
1.1.2.3. Приготовление срезов
1.1.2.4. Окрашивание препаратов и заключение в консервирующую среду

1.1.3. Методы окрашивания гистологических препаратов

1.1.3.1. Типы красителей
1.1.3.2. Общие методы окраски
1.1.3.3. Выявление неклеточных структур соединительной ткани
1.1.3.4. Окраска клеток соединительной ткани и крови
1.1.3.5. Выявление элементов нервной системы

1.1.4. Гистохимические методы исследования
1.1.5. Просмотр препаратов

Электронная микроскопия

1.2.1. Принцип работы электронного микроскопа
1.2.2. Особенности приготовления препарата

В гистологии, цитологии и эмбриологии существует много методов исследования.
Здесь рассматриваются лишь те, которые связаны со световой и электронной микроскопией мёртвых (фиксированных) клеток и тканей.

Световая микроскопия

Устройство микроскопа

1. Схема - строение светового микроскопа. В микроскоп входят 3 системы - оптическая, осветительная и механическая.

1. Оптическая система включает объектив и окуляр. а) Объектив (1) - это система линз, вставляемая в тубус (2) снизу и непосредственно направляемая на объект (отсюда - и название). Обычные увеличения объектива: 8 , 20 , 40 (сухие объективы), 90 (иммерсионный объектив). При использовании последнего объектива его следует погрузить в каплю кедрового (иммерсионного) масла, нанесённую на покровное стекло препарата. б) Окуляр (3) вставляется в тубус сверху. Применяются окуляры с увеличением 7, 10, 15. в) Результирующее увеличение микроскопа - произведение увеличений объектива и окуляра, например: 20 10 = 200 раз.

2. Осветительная система - источник света, зеркало, конденсор и диафрагма. а) Источник света (4) может быть встроен в микроскоп, а может находиться и вне микроскопа (пример - обычная настольная лампа). б) Зеркало (5) собирает лучи от источника и направляет их на препарат снизу. Одна поверхность зеркала - плоская, вторая - вогнутая; последняя используется при искусственном освещении. в) Конденсор (6) состоит из линз, которые фокусируют лучи света на препарате. Поднимая и опуская конденсор (с помощью винта), можно настраивать фокусировку лучей. г) Диафрагма (7) вмонтирована в конденсор; это система непрозрачных пластинок с отверстием посередине. Она ограничивает световой поток, падающий на препарат. При использовании объективов с большим увеличением отверстие диафрагмы следует уменьшить - для ослабления сферической аберрации.

3. Механическая система - тубус (2), штатив (8), колонка (9) и предметный столик (10). а) С колонкой связаны макро- и микрометрический винты, которые поднимают и опускают тубус для фокусировки изображения объекта на сетчатке глаза наблюдателя. Макровинт используется при работе на малом увеличении, а микровинт - на большом. б) Предметный столик может перемещаться в горизонтальной плоскости, что позволяет менять участки препарата, попадающие в поле зрения. В итоге, световые лучи проходят следующий путь: источник света (4) зеркало (5) конденсор (6) диафрагма (7) препарат объектив (1) тубус (2) окуляр (3). Т.е. микроскопия ведётся в проходящем свете, для чего препарат должен быть достаточно тонким. Заметим также, что микроскоп даёт перевёрнутое изображение объекта.

Взятие и фиксация материала

1. Из соответствующего органа вырезают небольшие кусочки (0,5 x 1 x 1 см) и погружают их в фиксатор (формалин, метанол и т.д.) - обычно на 24 ч. 2. Фиксация производится для предупреждения процессов аутолиза (самопереваривания) тканей. Это достигается путём денатурации (коагуляции) белков. 3. После фиксации образцы промывают проточной водой в течение нескольких часов.

Приготовление срезов

1. Кубики вставляют в специальный прибор - микротом, - служащий для приготовления срезов. 2. а) С помощью микрометрической механической системы объектодержатель вместе с кубиком перемещается за каждый шаг на определённое расстояние (напр., 10 мкм). б) А микротомный нож, направляемый под углом к поверхности парафинового блока, срезает с него тонкой слой органа (срез) заданной толщины. 3. Срезы помещают на поверхность тёплой воды для их расправления, а затем - на предметное стекло.

1.1.2.4. Окрашивание препаратов и заключение в консервирующую среду

1. Перед окрашиванием образцы освобождают от парафина, проводя по батарее растворителей: ксилол, спирт 100 %, 96 %, 80 %, 70 %, 60 %, вода (по 2-5 мин) (Этот ряд кончается водой в том случае, если затем используется водорастворимый краситель.) 2. Для окрашивания предметные стёкла со срезами помещают на короткое время в раствор красителя, промывают водой, обрабатывают раствором другого красителя (если таковой используется тоже) и вновь промывают водой. 3. Препарат опять обезвоживают (проводя по батарее спиртов с возрастающей концентрацией), а затем просветляют (в карбол-ксилоле и ксилоле) - для удаления лишней краски. 4. Наконец, на препарат наносят каплю канадского бальзама (в случае среза) или кедрового масла (на мазки крови) и накрывают покровным стеклом.

Таким образом, приготовление гистологического препарата - весьма долгая и
трудоёмкая процедура.
Но при правильном её выполнении полученный препарат может храниться неопределённо долгое время.

Типы красителей

Все красители, используемые в гистологической технике, подразделяются на 3 типа.-

Тип красителя	Пример	Окрашиваемые структуры
Кислые красители	Кислоты и кислые соли : эозин (искусственная краска; название - от греч. эос - заря); кислый фуксин.	а) Окрашиваемые структуры называются оксифильными (имеющими сродство к кислым красителям). б) Это белковые компоненты цитоплазмы и неклеточные структуры (коллагеновые волокна).
Основные красители	Основные соли : гематоксилин (точнее, продукт его окисления - гематеин); азур 2, кармин.	а) Красящиеся структуры - базофильные (сродство к основным красителям). б) Это структуры, богатые нуклеиновыми или иными кислотами - ядра, рибосомы, аморфный компонент межклеточного вещества.
Нейтральные красители	Смесь двух красителей: основного (азур 2) и кислого (эозин).	а) Структуры, воспринимающие кислые красители, окрасятся эозином; пример - специфические гранулы в эозинофильных лейкоцитах. б) Ядра всех клеток окрашиваются азуром 2.
Индифферентные красители	Судан III, судан IV	Суданом окрашиваются жировые капли (в которых он растворяется).

Существует большое количество различных способов окраски.
Те из них, которые встречаются в нашем курсе, перечислены ниже.

Общие методы окраски

1. Окраска гематоксилин -эозином	1.а) Самый распространённый метод окраски. б) Сочетает основной и кислый красители. в) Поэтому позволяет выявить почти все клетки и многие неклеточные структуры. 2. а) Ядра приобретают сине-фиолетовый цвет, б) цитоплазма -желтовато-розовыйцвет. 3. Замечание: используемый гематоксилин готовится по методу Эрлиха: окисляется до гематеина калийными квасцами.
2. Окраска железным гематоксилином(по методу Генденгайна)	1. Препарат предварительно обрабатывают (протравляют) железноаммиачными квасцами, а потом обрабатывают гематоксилином. 2. Структуры приобретают коричневато-серый цвет. 3. Хорошо выявляются структуры ядра, границы клеток, мышечные волокна.

Просмотр препаратов

1. Препарат - тонкая кишка собаки. Окраска гематоксилин-эозином. 1. На снимке мы видим внутреннюю поверхность тонкой кишки с находящимися на ней кишечными ворсинками (1). 2. а) Ядра клеток (2) - базофильны и окрашены гематоксилином в фиолетовый цвет. б) Цитоплазма (3) оксифильна и окрашена эозином в розовый цвет.

2. Препарат - белая жировая ткань. Тотальный препарат сальника. Окраска судан III -гематоксилином. 1. а) Препарат является тотальным. Это означает, что перед нами - не срез органа, а участок сальника, растянутого на предметном стекле. б) Таким образом, из 4-х перечисленных в п. 1.1.2. этапов приготовления препарата в данном случае опускаются два - уплотнение материала и приготовление среза (с последующим освобождением от уплотнителя). в) Остаются фиксация, окраска и заключение в консервирующую среду. 2. а) Жировые клетки на препарате заполнены крупными каплями жира (1), которые окрашены суданом Ш в ярко-оранжевый цвет. б) Клеточные ядра (2), окрашенные гематоксилином в фиолетовый цвет, оттеснены к периферии клетки.

3. Препарат - пластинчатая костная ткань. Поперечный срез трубчатой кости. Окраска по методу Шморля. 1. В процессе изготовления препарата костный материал подвергнут декальцинации (п. 1.1.3.3). 2. Применённый метод окраски позволяет выявить стенки костных полостей (1) и канальцев (2), окрашивающиеся в тёмно-коричневый цвет благодаря высокому содержанию здесь коллагеновых волокон. 3. В костных полостях находятся тела костных клеток (остеоцитов), а в канальцах - отростки этих клеток.

4. Препарат - срез яичника кролика. Окраска по методу Маллори. 1. В методе Маллори используются 3 красителя (п. 11.3.3), что делает картину многоцветной. 2. На снимке - женская половая клетка (ооцит), находящаяся в фолликуле яичника. 3.а) Цитоплазма (1) клетки окрашена в розовый, б) окружающая её блестящая оболочка (2) - в голубой, в) а ядра фолликулярных клеток (3) - в фиолетовый цвет.

Электронная микроскопия

Если в световом микроскопе увеличение составляет 100-1000 раз,
то в электронном микроскопе - 10.000 –100.000 раз (и выше), т.е. примерно в 100 раз больше.

Практические навыки получаемые на кафедре гистологии