Определение протеина С иммунохимическим методом
Иммунохимическое определение протеина С применяется реже, чем функциональные методы. Это объясняется тем, что данный способ выявляет только классическое снижение концентрации протеина С и не определяет его функциональную неполноценность. Методическим обеспечением этого определения чаще всего служат автоматизированный турбидиметрический метод или ELISA-тест.
Оценка результатов
В норме активность протеина С у взрослых составляет 70-140%.
Небольшое повышение протеина С отмечается во время беременности, а уменьшение - в послеродовом и послеоперационном периодах.
Снижение содержания (активности) протеина С наблюдается при:
• врожденном (наследственном) дефиците или
аномалиях протеина С;
• геморрагической болезни новорожденных;
• заболеваниях печени с нарушением функции;
• синдроме острой дыхательной недостаточно
сти;
• менингококковом сепсисе;
• ДВС-синдроме;
• гемодиализе;
• лечении L-аспарагиназой;
• лечении пероральными (непрямыми) антико
агулянтами (дефицит витамина К).
Отдельные результаты могут колебаться в
зависимости от используемых методов и тест-наборов, тем более что многие из них разработаны до того, как стала известна мутация гена фактора V Лейден. В общем случае разведение пробы может минимизировать влияние фактора V Лейден в коагуляционных тестах.
В некоторых случаях при лечении больных с дефицитом протеина С непрямыми антикоагулянтами у них могут возникнуть некрозы кожи в результате рикошетных тромбозов. Если антикоагулянты назначаются в высокой дозе без поддержки гепарином, то возникает состояние, при котором протеин С очень быстро снижается (время его полужизни в системе циркуляции 4-6 ч). В то же время витамин-К-зависимые факторы свертывания, в том числе протромбин, остаются еще в пределах нормы (у них период полужизни 16-20 ч) (рис. 116).
Рис. 116. Быстрое снижение протеина С,превышающее уменьшение витамин-К-зависимых факторов свертывания, может быть причиной возникновения тромботического состояния (рикошетные тромбозы) при начале лечения высокими дозами непрямых антикоагулянтов
Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ
Эта ситуация может усугубляться тем, что непрямые антикоагулянты начинают назначать в случае развития тромбозов или угрожающей ситуации по тромбообразованию (при воспалении, инфекциях, лихорадке), когда система прокоагулян-тов активирована. Быстрое снижение протеина С провоцирует в этом случае массивное тромбооб-разование, проявляющееся вплоть до некрозов кожи. Непосредственно в период лечения непрямыми антикоагулянтами (кумаринами) определение протеина С затруднено. Определять его следует до начала лечения кумаринами.
Определение протеина S
Протеин S - витамин-К-зависимый белок, который является кофактором АПС. Эта функция положена в основу всех известных коммерческих тест-систем определения протеина S. Описаны случаи как функционального, так и количественного дефицита протеина S. При проведении тестов важно помнить, что протеин S присутствует в плазме частично в свободном состоянии, частично в комплексе с С4-связывающим протеином (С4-СП), но активна только свободная форма протеина S.
Определение протеина S коагуляционным методом
Для определения протеина S необходимо использовать тест-систему, содержащую очищенный активный протеин С, его субстрат - фактор Va и дефицитную по протеину S плазму. После инкубации исследуемой плазмы с тест-системой определяют время свертывания, выполняя тест АЧТВ или индуцируя активацию змеиным ядом, фосфолипидами и Са2+ (рис. 117). Удлинение времени свертывания пропорционально активности протеина S. Специфичность метода относительная, так как фактор V Лейден, высокий уровень
ф.VIII и волчаночный антикоагулянт могут существенно влиять на результаты теста, а именно: с этими факторами часто проводят дифференциальную диагностику, определяя протеин S. На результаты влияют качество дефицитной плазмы и препаратов АПС, а также состав фосфолипи-дов, поэтому значения теста зависят от конкретного производителя. Так как коагуляционный метод подвержен действию многих интерферирующих факторов и не стандартизован, то предпочитают использовать иммунохимический метод для определения протеина S.
Определение протеина S иммунохимическим методом
Иммунохимический метод достаточно широко распространен. Первая генерация тест-наборов определяла «общий протеин S», включая свободную форму и форму протеина S, связанную с белком С4-СП. Наборы последних генераций позволяют определять «свободный протеин S» прямо без предварительной обработки. Чаще всего используют турбидиметрический метод с полистироловыми частицами или метод ELISA. Недостатком иммунохимического метода является то, что он выявляет протеолитически неактивные формы протеина S, которые иногда появляются в плазме.
Оценка результатов
Уменьшение содержания (активности) протеина S наблюдается при:
• врожденном (наследственном) дефиците;
• врожденном (наследственном) уменьшении
свободной фракции протеина S;
• заболеваниях печени с нарушением синтети
ческой функции;
• нефротическом синдроме;
• ДВС-синдроме;
Рис. 117. Принцип определения протеина S коагуляционным методом
Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ
• системной красной волчанке;
• лечении L-аспарагиназой;
• лечении пероральными (непрямыми) антико
агулянтами;
• приеме эстрогенов (пероральных контрацеп
тивов);
• беременности, в послеродовом периоде;
• наличии аутоантител к протеину S.
Относительный дефицит протеина S наблю
дается при повышении С4-СП. С4-СП - белок
острой фазы, его количество повышается в
плазме крови при воспалении, аутоиммунных
реакциях, беременности, у женщин, принима
ющих стероидные контрацептивы. С4-СП оп
ределяют методом иммунотурбидиметрии или
ELISA.
Определение антитромбина
В клинико-диагностических лабораториях AT определяют иммунохимическими методами (ELISA, турбидиметрия, нефелометрия), тестами с хромогенными субстратами или коагуляцион-ными методами.
Методом с хромогенным субстратом AT определяется через фактор Ха или Па при насыщающей концентрации гепарина. Принцип определения AT представлен на рис. 118. При выборе предпочтение отдают методу с использованием ф.Ха, так как он более стабилен и подвержен меньшим влияниям со стороны интерферирующих воздействий, чем тромбин (фактор На).
Нормальный уровень активности AT в плазме взрослых колеблется в диапазоне 75-125%, этот диапазон практически одинаков при использовании разных тест-наборов. Дефицит AT - серьезный фактор риска развития венозных тромбозов.
У новорожденных уровень AT составляет около 50% и достигает уровня взрослых к 6 мес.
Небольшое снижение AT наблюдается в середине менструального цикла, в пред- и послеродовом периоде, при токсикозах второй половины беременности, в послеоперационном периоде. Эти сдвиги более выражены у пациентов с группой крови А (II), а также у пожилых.
Снижение содержания (активности) А Т отмечается при:
• врожденном (наследственном) дефиците или
аномалии AT (снижение активности или чув
ствительности к гепарину);
• заболеваниях печени (опухоли, цирроз, алко
гольный гепатит);
• нефротическом синдроме (протеинурия свы
ше 5 г/л);
• карциноме легких;
• ДВС-синдроме;
• множественных травмах, тяжелых родах, по
здних гестозах;
• приеме эстрогенов (пероральных контрацеп
тивов), кортикостероидов;
• лечении L-аспарагиназой;
• многие протеазы, включая гранулоцитарную
эластазу, могут вызывать деградацию AT.
Тест может применяться для мониторинга
лечения гепарином. Длительная гепаринотера-пия может приводить к снижению активности AT в плазме. Лечение высокими дозами гепарина, особенно нефракционированным гепарином, приводит к транзиторному снижению AT по механизму потребления (рис. 119), особенно у больных с тяжелой патологией, в критических случаях, при ДВС-синдроме, сепсисе, злокачественных опухолях.
Увеличение содержания (активности) А Т отмечается во время менструации, а также при:
• остром вирусном гепатите;
• холестазе;
• приеме анаболических стероидов;
• лечении пероральными (непрямыми) антико
агулянтами.
Рис. 118. Принцип определения антитромбина (AT) хромогенным методом
Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ
Рис. 119.Снижение уровня AT в плазме в период активного лечения нефракционированным гепарином