С помощью коагуляционных методов
Принцип определения гепарина с использованием коагуляционных тестов подобен таковому в тестах с хромогенными субстратами. Определение основано на ингибировании свободного ф.Ха на первом этапе. После инкубационного периода выпадение сгустка вызывается добавлением реактивов, содержащих фосфолипиды с адсорбированными на них фактором V, протромбином, фибриногеном из бычьей плазмы и СаС12 (рис. 111). Автоматизация этого метода затруднена, так как сигнал достаточно слабый для оптического метода. Тест может выполняться на цельной крови на коагулометрах с механической системой регистрации.
Рис. 110. Принцип определения содержания гепаринас использованием хромогенного субстрата, AT - антитромбин
Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ
Рис. 111. Принцип определения содержания гепаринакоагуляционным методом
Преаналитические факторы, влияющие на результаты определения гепарина
Качество подготовки пробы - существенный фактор, влияющий на результаты определения гепарина. Нарушение взятия крови из локтевой вены может сопровождаться активацией тромбоцитов in vitro, что приведет к ложным результатам с недооценкой содержания гепарина в крови больных. При активации тромбоцитов освобождается фактор 4 тромбоцитов (PF4). PF4 выступает как естественный антигепарин, нейтрализу-
ющий как нефракционированный, так и низкомолекулярный фракционированный гепарин (НМГ), хотя следует отметить, что НМГ менее чувствителен к подавляющему действию PF4.
Для предупреждения этого эффекта и подавления активации тромбоцитов при транспортировке крови рекомендуется использовать специальные пробирки для крови, например CTAD tubes, в которых содержится цитрат, теофиллин, аденозин, декстроза - «коктейль», который предупреждает активацию тромбоцитов.
Методы для определения резистентности к активированному протеину С,
активности протеина S, антитромбина, антифосфолипидных антител
Резистентность к протеину С
Термин «резистентность к протеину С» введен при описании феномена практического отсутствия удлинения АЧТВ после добавления активированного протеина С (рис. 112). Устойчивость (резистентность) ф.Vа к ингибирующему воздействию активированным протеином С (РАПС) -один из серьезных факторов риска патологичес-
Рис. 112. Резистентность к активированному протеину С (АПС) при мутации в гене, контролирующем синтез фактора V, которая приводит к образованию фактора Лейден. Тест основан на определении АЧТВ
ких тромбозов. РАПС - нарушение функционирования системы протеина С.
Факторы, которые влияют на РАПС, представлены в табл. 26. РАПС может быть как врожденной, так и приобретенной. В случае наследования РАПС гетерозиготы имеют риск развития тромбозов примерно в 7 раз, а гомозиготы - в 80 раз выше, чем в среднем по популяции. РАПС была обнаружена среди 20% больных с первичным тромбозом глубоких вен бедра и среди 40% больных тромбо-филией. По разным данным от 20 до 60% больных с тромбозом глубоких вен бедра имеют РАПС.
Таблица 26
Факторы, влияющие на резистентность к АПС
Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ
Скрининговые тесты на АПС разработаны на основе модифицированного теста АЧТВ, который проводится с и без АПС, или на основе ПВ со змеиным ядом.
Тест резистентности фактора Va к АПС на основе модифицированного АЧТВ
Добавление АПС в норме вызывает удлинение АЧТВ за счет инактивации факторов Va и Villa в плазме. Поэтому в тесте сравнивается время выпадения сгустка в тесте АЧТВ с добавлением и без добавления АПС и рассчитывается отношение (рис. 114). Референтные значения теста зависят от используемых реактивов и приборов. Тем не менее, несмотря на разные методы и приборную базу, обычно добавление АПС к плазме приводит, по крайней мере, к 2-кратному удлинению АЧТВ (табл. 27).
Недостаточное удлинение АЧТВ (патологический результат, свидетельствующий о РАПС) наблюдается у пациентов с фактором V Лейден, волчаночным антикоагулянтом, при беременности, увеличенном содержании фактора VIII и при-
еме оральных контрацептивов. Этот тест имеет специфичность для выявления фактора V Лейден примерно 80%, неполная специфичность связана с влиянием на результат других факторов, в частности с подавлением активности фактора VIIIa. На результаты теста оказывают влияние прием непрямых антикоагулянтов и введение гепарина. Тест полезен для выявления пациентов с высоким риском тромбоэмболической болезни.
Тест для диагностики фактора V Лейден
Мутация гена фактора V (фактор Лейден) оценивается как наиболее распространенная причина РАПС. Эту патологию можно выявить при проведении теста на РАПС с плазмой пациента, разбавленной 1:5 плазмой с дефицитом ф.V. Этот тест обладает высокой специфичностью и чувствительностью на выявление фактора V Лейден (табл. 28).
Тест на РАПС проводится также с использованием змеиного яда, обозначаемого как протак (Рго-tac), специфически активирующего протеин С. При внесении активатора протеина С в смесь нор-
Примеры резистентности к активированному протеину С
Таблица 27
Таблица 28
Примеры определения резистентности к активированному протеину С методом без разведения и методом разведения испытуемой плазмы плазмой с дефицитом ф. V
Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ
мальной и дефицитной по ф.V плазмы время свертывания в тесте АЧТВ удлиняется примерно в 2 раза. Если имеется РАПС, удлинение АЧТВ выражено в малой степени.
Определение протеина С
Для определения протеина С разработано несколько методов: иммунохимический метод, метод с хромогенным субстратом и коагуляцион-ный вариант. Для функциональных методов используется специфический активатор протеина С из яда змеи щитомордника, обозначаемый как протак.
Определение протеина С с использованием хро-могенного субстрата
Рис. 113. Принцип определения протеина Сс использованием хромогенного субстрата, АПС - активированный протеин С |
Определение основано на активации протеина С активатором протак с последующим определением (кинетическим методом или методом конечной точки) изменения оптической плотности пробы из-за образования паранитроанилина (рис. 113). Этот метод прост, специфичен, легко автоматизируется. Так как протеин С - витамин-К-зависимый гликопротеин, то при лечении непрямыми антикоагулянтами (антагонистами витамина К) появляются PIVKA-формы протеина С, которые не обладают антикоагулянтной активностью, но определяются методами с хромоген-ными субстратами. Поэтому у больных, принимающих непрямые антикоагулянты, могут быть завышенными результаты определения протеина С хромогенными методами.
разцах исследуемой плазмы активируется про-таком. Для контроля тест проводится с и без протака (рис. 114). Активированный протеин С вызывает протеолиз и соответственно инактивацию факторов Va и VIIIa в плазме (рис. 115). Последнее сопровождается удлинением времени свертывания в тесте АЧТВ, по которому оценивается активность протеина С в плазме пациента. Если фактор Va нечувствителен к активному протеину С, то АЧТВ не удлиняется в присутствии активатора протеина С. Рассчитывают отношение АЧТВ с протаком/АЧТВ без протака, величина которого определяется в конкретной лаборатории, так как тест зависит от использованных приборов и реактивов. Тем не менее этот коэффициент близок к 1 практически у всех больных с фактором Лейден и с дефицитом протеина С и существенно выше 1 в случаях без дефицита активности протеина С и при дисфункции протеина S. Метод легко автоматизируется.
Коагуляционный метод оценивает активность протеина С, фиксирующегося карбоксили-рованной частью на фосфолипидах. PIVKA-формы не функционируют в этой системе, и тест не дает ложных результатов у пациентов, принимающих непрямые антикоагулянты или имеющих дефицит витамина К.
Исказить результаты теста могут такие факторы, как наличие мутации ф.V Лейден, присутствие в плазме волчаночного антикоагулянта,
Определение протеина С коагуляционным методом
Пробы пациентов сопоставляются с дефицитной по протеину С плазмой, которую получают методом иммуносорбции. Протеин С в об-
Рис. 114. Принцип скрининга на резистентность к активированному протеину С (РАПС).Активатор протеина С из змеиного яда (протак), добавленный к пробе, в норме существенно удлиняет АЧТВ, Если же имеет место РАПС, то удлинения АЧТВ в присутствии протака не происходит
Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ
Рис. 115.Принцип определения протеина С коагуляционным методом.АПС - активированный протеин С, ФЛ фосфолипиды
терапия гепарином. Для получения достоверных результатов очень важно качество используемой протеин-С-дефицитной плазмы.
У некоторых пациентов, принимающих непрямые антикоагулянты, выявляются чрезвычайно низкие цифры содержания протеина С. Эти результаты могут быть связаны не только с истинным дефицитом протеина С, но и с развитием резистентности фактора Va к АПС.