Обеспечение диагностики нарушении гемостаза в

Общие подходы

Исследование нарушений гемостаза прово­дится в несколько этапов.

Перед проведением лабораторного исследо­вания собирается анамнез. Во-первых, необходи­мо выяснить наличие клинических признаков ге­моррагического или тромботического заболева­ния у пациента. Во-вторых, требуется определить наличие таких признаков у членов семьи. Рас­спрос о семейных заболеваниях - очень важный этап, так как многие нарушения гемостаза насле­дуются. При сборе анамнеза необходимо обра­щать внимание на то, имеются ли признаки врож­денного нарушения гемостаза или это приобре­тенное состояние. При наличии признаков при­обретенного нарушения гемостаза необходимо учитывать сопутствующие заболевания и симп­томы, а также применяемые пациентом медика­ментозные препараты, которые могли повлиять на гемостаз.

Однако данные анамнеза являются субъек­тивной информацией и не всегда помогают в ус­тановке правильного диагноза. Клиническое об­следование пациента выявляет ряд признаков на­рушения гемостаза - петехии, синячки на коже, кровоизлияния в слизистые оболочки, признаки венозного застоя или артериальной недостаточ­ности и др. Необходимость сбора анамнеза и ос­мотра перед началом лабораторного обследова­ния важна еще и потому, что проведение всех воз­можных тестов оценки состояния системы гемо­стаза - чрезвычайно дорогостоящее занятие. Кро­ме того, в настоящее время нет лабораторных те­стов, позволяющих досконально охарактеризо­вать все звенья системы гемостаза. Поэтому на предварительном этапе необходимо выбрать ра­циональную палитру тестов, наиболее соответ­ствующую клинической картине нарушений у данного пациента.

На следующем этапе рекомендуется провес­ти некоторое количество скрининговых тестов, которые позволят определить направленность нарушения. И лишь на следующем этапе рацио­нально выполнить соответствующие данным кли­нической картины и скрининговых тестов анали­зы, способные выявить конкретные нарушения гемостаза у пациента.

Важно понимать, что применяемые тесты должны быть информативными, то есть обладать высокой чувствительностью по выявлению пато­логии и достаточной специфичностью. В любом случае лучше использовать несколько тестов, чем искать один даже самый специфичный тест, так как сама комбинация дает дополнительную и зачастую решающую информацию. Это объяс­няется тем, что практически все элементы систе­мы гемостаза в той или иной степени связаны, изменение в одном элементе затрагивает и дру­гие его звенья. Поэтому во всех случаях при на­значении и проведении расширенной коагу-лограммы необходим тесный контакт с лечащим врачом и, может быть, совместное с ним назна­чение перечня дорогих и редких, но обоснован­ных исследований.

Так как лабораторное исследование гемоста­за может быть достаточно дорогим, следует до­казывать администрации, что лечение больных с тромбозами и патологическими кровотечения­ми значительно дороже, чем любые лаборатор­ные исследования. А затраты на приобретение качественных реактивов и оборудования окупа­ются исключением повторных исследований и проведением адекватной, эффективной и контро­лируемой терапии.

Помимо коагулологических тестов, при ис­следовании нарушений гемостаза большую по­мощь оказывают лабораторные тесты общего

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

назначения. Они могут указать на заболевания печени или почек, которые имеют значение для синтеза и катаболизма факторов гемостаза. Опу­холь с метастазами способна стать причиной тромбоза. Лекарственные препараты могут вы­зывать кровотечения, а в некоторых случаях пе­редозировка прямых и непрямых антикоагулян­тов, наоборот, приводит к тромбофилии.

Важную информацию о причинах развиваю­щихся тромбозов и кровотечений могут дать та­кие лабораторные исследования, как общий ана­лиз крови, определение гомоцистеина, витами­нов, гормонов, наличие аутоантител. Для паци­ентов, леченных препаратами крови, необходи­мо проводить тесты на вирусоносительство.

Преаналитический этап

Взятие крови

Существенное значение имеет, на какой кро­ви выполняется тот или иной тест: на цельной, стабилизированной капиллярной или на плазме венозной крови.

Капиллярная кровь

Капиллярная кровь как диагностический ма­териал имеет ограниченное значение. Тем не ме­нее у больных, принимающих непрямые антикоа­гулянты, использование капиллярной крови из пальца позволяет избежать повторного травмиро­вания и тромбирования вен, затрат времени на центрифугирование крови и отделение плазмы. При этом использование капиллярной крови уве­личивает вероятность преаналитической ошибки; становится сложнее стандартизовать исследова­ние, требуются специальные реактивы и оборудо­вание. Стоимость реактивов для исследования про-тромбинового времени в капиллярной крови выше, их стабильность ниже, чем обычного тром-бопластина, используемого для анализа плазмы венозной крови. Для избежания неверных резуль­татов капиллярная кровь может использоваться только для некоторых специально адаптирован­ных методов: подсчет тромбоцитов, определение времени кровотечения, определение протромбино-вого (ПВ) и активированного частичного тром-бопластинового времени (АЧТВ). Определение АЧТВ в капиллярной крови используется исклю­чительно для мониторинга гепаринотерапии.

Определение ПВ в капиллярной крови ис­пользуется в основном для контроля за приемом непрямых антикоагулянтов в амбулаторных и домашних условиях, а также для экспресс-диаг­ностики у детей первых месяцев жизни.

Фирма «Roche Diagnostics» выпускает комби­нированный тромбопластиновый реагент «Hepato Quick», который специально предназначен для ра­боты с капиллярной кровью. В состав реактива входят тромбопластин, фактор V и фибриноген, для определения используется 20 мкл цельной кро­ви. Реактив прокалиброван. Для проведения ра­бот по контролю качества используются специаль­но подготовленные лиофилизированные плазмы. При использовании реактива предусмотрена воз­можность коррекции влияния гематокрита на ре­зультат теста. Все эти условия позволяют прово­дить контроль за антикоагулянтами непрямого действия по протромбиновому тесту, выполняемо­му на полученной из пальца капиллярной крови. Этот метод оценивает международное нормализо­ванное отношение (MHO) в микрообъемах цель­ной или стабилизированной цитратом капилляр­ной крови. Существенным ограничением метода является то, что используемый в нем реагент сло­жен, дорог и малодоступен многим практическим лабораториям. Одновременно фирма «Roche» пред­лагает портативный прибор «CoaguCheck Plus» для определения ПВ и АЧТВ, в котором в качестве биологического материала используется капля капиллярной крови. Прибор может применяться в амбулаторных условиях или самостоятельно па­циентами для контроля терапии непрямыми анти­коагулянтами (рис. 65).

Основные проблемы и рекомендации при рабо­те с капиллярной кровью:

• При прохождении крови через поврежденную
ткань активируется свертывание, длитель­
ность взятия крови является критическим по­
казателем.

• Немецкий стандарт DIN 58910-D: кровь, вы­
текающая самотеком, должна быть забрана

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Рис. 65. Портативный прибор «CoaguCheck Plus» (фирма «Roche») для определения ПВ и АЧТВ:

А- общий вид и картридж для программирования прибора, Б - тест-полоска вводится в прибор, В -капля капиллярной крови наносится непосред­ственно на тест-полоску, помещенную в прибор, Г - результат готов через несколько минут, причем данные по протромбиновому времени (ПВ) пред­ставляются сразу в единицах международного нор­мализованного отношения (MHO)

в стерильный капилляр и перенесена в нитрат­ный буфер в течение 10 с. Чистое и сухое ме­сто кончика пальца или ушной мочки пунк­тируется стерильным скарификатором. Про­кол должен быть достаточно глубоким, что­бы кровь текла самотеком. Не допускается давление или сжатие. Для исследования ис­пользуются первые капли крови, берется 10-50 мкл в стерильный капилляр, который дер­жится горизонтально, один конец касается места прокола. В капилляре кровь с цитра­том не перемешивается, предварительный забор антикоагулянта только усложняет про­цедуру. Капиллярная кровь при взятии в про­бирку с цитратом должна быть перемешана во время или сразу после взятия. Не допуска­ется, чтобы кровь стекала на дно по стенке пробирки, она должна прямо скапывать в цитрат, перемешиваясь с ним (рис. 66).

Венозная кровь

До настоящего времени венозная кровь - ос­новной источник материала для анализа состоя­ния гемостаза. Взятие венозной крови - крити­ческая процедура для тестов на коагулограмму. Взятие крови должно быть приурочено ко време­ни исследования, чтобы свести до минимума вре­мя хранения проб. В то же время, учитывая су­точные биоритмы, рекомендуется брать кровь на

исследование утром от 7 до 9 часов. Необязатель­но брать кровь строго натощак, можно рекомен­довать пациенту легкий завтрак, но без жировой

Рис. 66. При взятии крови в антикоагулянтне допускает­ся стекание крови по коже пальца, по стенке пробирки и любой другой поверхности, так как мгновенно происходит контактная активация процесса свертывания. Кровь само­теком из прокола должна попадать прямо в антикоагулянт, перемешиваясь с ним

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

пищи. Исследование рекомендуется проводить у пациентов, отдохнувших не менее 15 мин после незначительной физической нагрузки.

Важным моментом является длительность наложения манжеты. Во время венопункции дли­тельность венозного стаза рекомендуется не бо­лее 1 мин, а сила сжатия - ниже на 10 мм Hg диа-столического давления крови. Стаз крови при длительном наложении манжеты вызывает акти­вацию фибринолиза, повышение концентрации факторов гемостаза из-за освобождения белков из сосудистой стенки (в том числе t-PA и vWF) и активацию тромбоцитов. Так, после 3 мин стаза крови происходит укорочение ПВ, АЧТВ и тром-бинового времени, примерно на 10% повышает­ся количество антитромбина, фибриногена и дру­гих факторов свертывания, ф.VIII в отдельных случаях повышается более чем на 20%.

Кровь берут из локтевой вены утром натощак силиконированной иглой с широким просветом (внутренний диаметр 1,0 - 0,8 - 0,6 мм) без шпри­ца (самотеком). Использование шприца нежела­тельно. Если кровь брать слишком быстро, то из-за турбулентного движения крови в шприце и сме­шивании ее с воздухом (вспенивание) происходит активация тромбоцитов (сопровождается измене­нием формы тромбоцитов и освобождением из них тромбоцитарных факторов) и факторов свер­тывания крови. Если кровь брать медленно, то в шприце может начаться необратимое свертыва­ние, опять же с активацией факторов гемостаза.

В современной лабораторной практике все чаще используются системы вакуумного забора крови (вакутейнеры и вакуэты). Активация гемо­стаза в них предотвращается за счет моменталь­ного смешивания поступающей крови с раство­ром цитрата натрия. Если в силу технических об-

стоятельств забор крови проводится пластико­вым (не стеклянным) шприцем, необходимо вы­полнять эту манипуляцию как можно аккуратнее, избегая вспенивания и резкого поступления кро­ви в шприц. После этого кровь необходимо так­же аккуратно в минимальные сроки перенести в пластиковую или стеклянную силиконированную пробирку с раствором цитрата натрия.

При прокалывании иглой сосуда тканевый тромбопластин попадает с током крови в пробир­ку, поэтому первые капли крови не годятся для проведения коагулологических тестов. Кровь на гемостаз желательно брать во вторую пробирку. Кровь из первой пробирки рекомендуется исполь­зовать для подсчета форменных элементов. Так, например, АЧТВ, определяемое в первой пробир­ке, может быть на 20% короче, чем во второй.

Кровь рекомендуется брать:

• «бабочкообразной» иглой в градуированную
силиконированную стеклянную или пласти­
ковую пробирку, содержащую антикоагу­
лянт;

• в градуированный пластиковый шприц, со­
держащий антикоагулянт;

• в моноветт - коммерческая аспирационная
система (градуированный шприц), содержа­
щая антикоагулянт;

• в вакутейнер - коммерческая система (про­
бирка с определенным отрицательным давле­
нием для взятия точного объема крови), со­
держащая антикоагулянт (рис. 67);

• в специальные пробирки для транспортиров­
ки крови для исследования гемостаза. Напри­
мер, пробирка СТАД (рис. 68) содержит цит­
рат натрия (0,105 М), теофиллин, аденозин и
дипиридамол. Три последних вещества пред­
отвращают активацию тромбоцитов. СТАД

Рис. 67. Вакутейнер - система для взятия венозной крови, состоит из аспирационной иглы, переходника и пробирки с отрицательным давле­нием для набора крови, После введения иглы в вену пробирки могут меняться, при этом в каждую берется дозированная порция крови

Рис. 68. Пробирка СТАД специально создана для транспортировки крови на исследование гемостаза, содержит цитрат натрия (0,105 М), теофиллин, аденозин и дипиридамол

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

существуют и в виде вакутейнеров. Скринин-говые тесты и исследования отдельных фак­торов свертывания могут выполняться из СТАД так же, как из цитратной плазмы. В некоторых клинических ситуациях (напри­мер, при шоке) извлечение крови из локтевой вены затруднительно из-за низкого давления. Попытки набирать кровь с помощью шприца часто закан­чиваются неудачей: кровь сворачивается. В не­отложных ситуациях, когда невозможно взятие крови из периферической вены, можно использо­вать кровь, полученную из центрального (подклю­чичного) катетера. При этом желательно удалить до 10 мл крови (использовать ее на проведение ге­матологических или биохимических исследова­ний), а затем забрать кровь на коагулологические исследования. Такой способ взятия крови приме­ним только в тех случаях, когда в катетер не вво­дился гепарин. Если же через этот катетер гепа­рин вводился, то удаляют до 20 мл крови, а затем берут кровь на исследование гемостаза. Тем не менее даже в этом случае приоритет должны по­лучать гепарин-независимые тесты (ПВ, рептилаз-ное время, фибриноген, фибрин-мономеры, анти­тромбин), так как сохраняется высокая вероят­ность влияния следов гепарина на такие тесты, как АЧТВ, тромбиновое время.

Положение тела

Положение тела влияет на состав крови, чис­ло клеток, состав белков и белково-связываю-щих макромолекул, особенно выраженные изме­нения наблюдаются у пациентов с отеками. Уро­вень этих показателей всегда выше в положении стоя, так как при этом часть жидкости из сосу­дистого ложа переходит в окружающие ткани. При переходе из стоячего положения в сидячее, а особенно в положение лежа, жидкость быстро возвращается в сосуды («разведение крови»), этот эффект в большей степени выражен у паци­ентов с отеками. У здоровых людей через 8 ч ле­жания в постели концентрация фибриногена и ак­тивность антитромбина в крови примерно на 20% ниже, чем после 1 ч в положении стоя. У больных с отеками эта разница будет еще больше. Поэто­му при мониторинге за состоянием пациента кровь всегда нужно брать из одного и того же положения пациента.

Влияние физической нагрузки и эмоционального стресса

Физическая нагрузка и эмоциональные пере­живания сопровождаются изменениями плазмен­ного гемостаза, фибринолиза и функции тромбо­цитов. После серии приседаний содержание в плазме фактора Виллебранда (vWF:Ag) увеличи­вается до 50%о, у спортсменов после бега на 10 км содержание ф.VIII повышается на 60%, vWF -примерно в 3 раза, что приводит к укорочению АЧТВ. Активация фибринолиза после физичес­кой нагрузки связана с повышением в плазме тка­невого активатора плазминогена (t-PA). Анало­гичные изменения наблюдаются у пациентов, пе­ренесших эмоциональный стресс.

Влияние факторов преаналитического этапа на показатели плазменного гемостаза представ­лено в табл. 10.

Влияние пищи на показатели гемостаза

Практика показывает, что исследование ге­мостаза необязательно проводить натощак. Лег­кий завтрак без жира даже показан перед взяти­ем крови на исследование гемостаза.

Характер пищи после длительного периода голодания оказывает влияние на показатели плаз­менного гемостаза и фибринолиза.

Жирное мясо уменьшает фибринолитическую активность, в то же время бесхолестериновая ди­ета способствует повышению фибринолитичес-кой активности крови.

Фрукты и зеленые овощи в большом количе­стве способствуют активации фибринолиза в ос­новном за счет уменьшения ингибитора актива­тора плазминогена (PAI-1).

Рыбная диета в течение нескольких недель сопровождается уменьшением количества и агре­гации тромбоцитов, а также снижением фибри­нолиза. Уменьшение агрегации тромбоцитов объясняется увеличением в их мембране полине­насыщенных жирных кислот, которыми богата рыба и морепродукты.

Витамин С, витамин Е, лук и чеснок могут вызвать нарушения агрегации тромбоцитов.

Витамин К в организме человека частично синтезируется микрофлорой кишечника, частич­но поступает с пищевыми продуктами. Несмотря на то что при применении per os антибиотиков

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Влияние различных факторов преаналитического этапа на результаты коагулологических исследований

Таблица 10

Преаналитические факторы	Влияние
Время суток	Снижение содержания факторов свертывания и повышение уровня PAI-1 в ночное время
Прием пероральных контрацептивов	Повышение активности большинства факторов свертывания, агрегации тромбоцитов, снижение уровня AT
Длительный стаз (более 3 мин)	Увеличение фибринолитической активности, укорочение АЧТВ, ПВ, ТВ, повышение уровня фибриногена, AT
Стресс, физическая нагрузка	Повышение фибринолитической активности (уровня t-PA), укорочение АЧТВ, активация фактора VIII, увеличение vWF
Положение тела	В положении стоя происходит относительное увеличение содержания факторов свертывания
Температура +18... +24 °С в течение 8 часов	Снижение активности факторов VIII, V и IX (удлинение АЧТВ)
Температура +4 °С	Увеличение активности факторов VII, XI и XII

широкого спектра могут возникнуть кровотече­ния из-за недостатка витамин-К-зависимых фак­торов, тем не менее для организма важен и пище­вой витамин К. Витамин К в больших концент­рациях содержится в овощах (шпинате, кабачках), злаках и печени. ПТ может стать патологически удлиненным, если полностью заменить в пище хлеб на помидоры, которые не содержат витами­на К. У больных, принимающих непрямые анти­коагулянты, исключительно овощная диета в больших количествах требует дополнительной корректировки антикоагулянтного потенциала крови по ПТ. Если такую коррекцию проводить, то овощная диета не будет доставлять особых проблем пациентам, принимающим непрямые ан­тикоагулянты.

Алкоголь влияет на показатели системы гемо­стаза в зависимости от дозы. После приема алко­голя наблюдается уменьшение антитромбина и фибриногена, повышение ингибитора активато­ра плазминогена и уменьшение времени крово­течения. Хронический алкоголизм сопровожда­ется уменьшением количества тромбоцитов и на­рушением их агрегации, которые однако доста­точно быстро восстанавливаются после выхода из запоя.

Кофе даже после 5 чашек не влияет на пока­затели свертывания крови. Большие дозы кофеи­на повышают количество t-PA и уменьшают ак­тивность PAI-1.

Курение приводит к увеличению агрегации тромбоцитов и их адгезии, повышению β-тром-боглобулина, t-PA, активности PAI-1 и фибрино­гена, снижению ф.VII.

Кокаин в большой дозе может вызвать на­столько сильную активацию и агрегацию тром­боцитов, что это перерастает в тяжелую тромбо-цитопению и ДВС-синдром.

Интерферирующие лекарственные препараты

Оральные контрацептивы повышают актив­ность большинства факторов плазменного гемо­стаза, увеличивают агрегацию тромбоцитов и снижают уровень протеина С и протеина S. Как правило, сами оральные контрацептивы не вы­зывают клинических проявлений патологии гемо­стаза, но они резко увеличивают вероятность тромбозов при наличии наследственных или при­обретенных риск-факторов тромбофилий.

Валъпроиковая кислота (используется в пре­паратах для лечения эпилепсии) может вызвать тромбоцитопению, уменьшение уровня фибрино­гена, состояние, имитирующее болезнь Виллеб-ранда II типа.

Аспарагиназа (препарат для лечения лимфо-бластных лейкозов) может приводить к снижению фибриногена, уменьшению антитромбина, про­теинов С и S, витамин-К-зависимых факторов, снижению плазминогена.

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Антибиотики широкого спектра действия могут привести к различным отклонениям в по­казателях гемостаза. Принимаемые внутрь анти­биотики вызывают дефицит витамина К в орга­низме за счет подавления активности бактериаль­ной микрофлоры. После назначения высокой дозы пенициллина наблюдалась тромбоцитопе-ния, нарушения функций тромбоцитов, удлине­ние тромбинового времени.

Анальгетики (нестероидные противовоспали­тельные, антиревматоидные, жаропонижающие препараты), содержащие ацетилсалициловую кислоту, влияют на функцию тромбоцитов. Нео­братимое ингибирование циклооксигеназы вызы­вает подавление, вплоть до полного отсутствия, адгезии тромбоцитов. Другие анальгетики (индо-метацин, фенилбутазон, диклофенак) подавляют агрегацию тромбоцитов в меньшей степени, чем аспирин.

Подбор антикоагулянтов

Материалом для коагулологических исследо­ваний является плазма (рис. 69).

Для получения плазмы или крови для лабо­раторных исследований используют противосвер-тывающие вещества (табл. 11). Согласно стандар­ту для производителей DIN ISO Standard 6710 коммерческие пробирки с антикоагулянтом ме­тятся цветом крышки: пробирки с ЭДТА закры­ты крышкой светло-лилового (лаванды) цвета, пробирки с гепарином - зеленой, пробирки с цит­ратом - синей крышкой.

Трехзамещенный цитрат натрия обладает специфической способностью стабилизировать

Рис. 69. Получение фракций крови для проведения ко­агулологических исследований

лабильные факторы свертывания (V и VIII). Цит­ратная плазма, обогащенная тромбоцитами, ис­пользуется для изучения их агрегации. В связи с этим цитрат натрия является антикоагулянтом выбора для коагулологических исследований. В соответствии с рекомендацией ВОЗ концентра­ция цитрата должна быть 109 ммоль.

Кровь смешивают с 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1. На этом этапе могут быть допущены три ошибки.

Первая ошибка - неточность приготовления раствора стабилизатора. Важно учесть, что трех­замещенный 5,5-водный цитрат натрия готовится в концентрации 3,8% (0,11 моль), а 2-водный - в кон­центрации 3,2%) (0,11 моль). Американский Коми­тет Стандартизации Клинических Лабораторий

Применение и механизм действия антикоагулянтов

Таблица 11

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

рекомендует для коагулологических исследовании буферный раствор 3,2% цитрата. Забуферивание ан­тикоагулянта способствует большей стабилизации лабильных факторов свертывания. Хранение ра­створа цитрата допускается в течение 1 недели при +2...+8 °С. Более длительное хранение приводит к бактериальному загрязнению и снижению концен­трации цитрата натрия.

Вторая ошибка связана с тем, что нарушает­ся принятое соотношение крови и раствора цит­рата (9:1), поскольку раствор цитрата остается в плазме и не проникает в клетки крови. Считает-

ся, что в пределах разведения крови цитратом 9:1 и 12:1 практически нет различий в результатах коагулологических тестов. Большее количество антикоагулянта по отношению к плазме может вызвать удлинение ПВ и АЧТВ (рис. 70).

Такая ситуация может возникнуть, когда в приготовленную заранее пробирку с цитратом набрано слишком мало крови (рис. 71).

Аналогичная ситуация возникает при раз­ном гематокрите (рис. 72): гематокрит в преде­лах между 0,25-0,55 (25-55%) несущественно вли­яет на результаты, при гематокрите свыше 60%

Рис. 70. Влияние разведе­ния крови антикоагулян­томна протромбиновый тест (ПТ) и активированное частичное тромбопластино-вое время (АЧТВ), Разведе­ние крови антикоагулянтом сопровождается удлинени­ем ПВ (снижение ПТ) и АЧТВ, при разведении меньшем, чем 8:1, это приводит к ре­гистрации ложноположи-тельного результата

Рис. 71. Взято недостаточное количество крови в ан­тикоагулянт- типичная преаналитическая ошибка. Боль­шее количество антикоагулянта по отношению к плазме может вызвать значительное изменение показателей ко-агулограммы

Рис.72. Соотношение объема плазмы и раствора цитра­та при разном гематокрите. При высоком гематокрите со­здаются условия избыточного количества антикоагулянта и слишком сильного разведения плазмы с получением ре­зультатов, соответствующих состоянию гипокоагуляции. Наоборот, при низком гематокрите есть высокая вероят­ность регистрации «ложной» гиперкоагуляции

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

создается избыточная концентрация цитрата в плазме, приводящая к «ложной» гипокоагуля-ции. Напротив, при снижении гематокрита (ниже 25%) обнаруживается «ложная» гиперко­агуляция, кровь при смешивании с цитратом в отношении 9:1 может свернуться в пробирке еще до исследования. Высокий гематокрит - физио­логическая характеристика крови новорожден­ных, у взрослых высокий гематокрит возникает при полицитемиях (эритремиях), сердечной не­достаточности.

Перерасчет объема стабилизатора в соответ­ствии с гематокритным показателем позволяет избежать этой ошибки (табл. 12). Если же у боль­ного нет значительного сгущения крови или, на­оборот, анемизации, приемлемо стандартное со­отношение крови и цитрата (9:1).

Таблица 12

Соотношение объема антикоагулянта и венозной крови для постановки коагулограммы

Третья ошибка. Наиболее частой погрешно­стью при взятии крови является плохое или недо­статочное перемешивание ее со стабилизатором. Для предотвращения этого требуется немедлен­но после заполнения пробирки кровью до требу­емого объема закрыть ее крышкой (не резиновой) или чистой полиэтиленовой пленкой и 2-3 раза медленно перевернуть (не встряхивая).

Для рекальцификации к цитратной плазме добавляют определенное количество хлорида кальция. Причиной изменения времени сверты­вания может стать несоответствие добавляемо­го кальция содержанию цитрата: коагулологи-ческие исследования являются более чувстви­тельными к избытку кальция в плазме (высокий

гематокрит, слишком мало крови), чем к его не­достатку (низкий гематокрит, слишком много крови).

Для некоторых тестов рекомендуются специ­альные антикоагулянты. При исследовании фун­кции тромбоцитов практически любой антикоа­гулянт может быть источником ошибок. ЭДТА, флуорид и гепарин не используются при прове­дении традиционных тестов коагулограммы.

Сыворотка

Сыворотка, естественно, не может быть ис­пользована в тестах, основанных на определении выпадения фибрина. Кроме того, сыворотка практически не содержит факторов II, V, VIII и XIII, которые удаляются со сгустком, в сыворот­ке частично сохраняются ф.VII, -IX, -X и -XII. Сы­воротку можно использовать для исследования некоторых компонентов, на определение которых оказывают интерферирующий эффект компонен­ты плазмы, в частности, в сыворотке можно оп­ределять содержание продуктов деградации фиб­рина/фибриногена (ПДФ).

Хранение и центрифугирование

Кровь в пробирке необходимо тщательно перемешать, перевертывая пробирку, при этом не допускается образования пены. Нельзя трясти пробу, так как это может вызвать денатурацию белков и активацию тромбоцитов.

Сразу же после взятия крови происходит из­менение активности компонентов системы свер­тывания и фибринолиза. В пробе, не закрытой пробкой, возрастает рН из-за потери СО₂. След­ствием этого является увеличение времени свер­тывания. На стабильность рН пробы влияет бу­ферная система эритроцитов, а также использо­вание буферных растворов цитрата. В пробе кро­ви, хранящейся при комнатной температуре и зак­рытой пробкой, не происходит заметных измене­ний в результатах ПВ и АЧТВ. Эффект физиоло­гического забуферивания за счет эритроцитов исчезает в открытой пробирке при попадании в нее атмосферного воздуха.

Согласно международным рекомендациям срок доставки проб в лабораторию (ARUP Laboratories, 2002) для исследования показате-

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

лей гемостаза не должен превышать 45 минут

после взятия крови у пациента. Стабилизиро­ванную кровь до центрифугирования (в том числе и в процессе транспортировки) хранят при комнатной температуре (+18... +25 °С). Транспортировка крови на большие расстоя­ния и ее частое встряхивание искажают резуль­таты исследования. Кровь нельзя хранить во льду (что делается в некоторых клиниках), так как это может привести к холодовой актива­ции фактора XII (процесс запускается через контактную фазу и развивается достаточно ча­сто) и вызвать значительные изменения функ­ции тромбоцитов.

Центрифугирование для получения плазмы должно проводиться при ускорении 1500-2000 g в течение 10 минут, при этом получается плазма, «бедная» тромбоцитами. Если пробы необходи­мо заморозить перед проведением теста, то пос­ле размораживания рекомендуется повторно от-центрифугировать пробу и работать с суперна-тантом. Это делается для удаления остатков раз­рушенных тромбоцитов, фосфолипидов и белков их мембран, которые могут влиять на некоторые коагуляционные тесты.

Проверка исследуемых образцов перед выполнением тестов

Проверка образцов крови или плазмы перед проведением коагуляционных тестов позволяет избежать многих ошибок, связанных с преанали-тическими погрешностями.

Неправильное соотношение кровь/цитрат можно определить, если объем крови в пробирке меньше или больше, чем требуемый. При малом объеме крови будет зарегистрировано ложное удлинение коагуляционных тестов.

Пробы с видимыми сгустками фибрина. В за­висимости от степени свертывания коагуляцион­ные тесты могут быть укорочены, нормальны или удлинены.

Гемолиз может произойти при хранении не-отцентрифугированной крови или после центри­фугирования. В таких тестах результаты варьи­руют в зависимости от степени гемолиза. Если гемолиз присущ in vivo, что подтверждается взя­тием нового образца, то тесты могут выполнять­ся для оценки гемостатической ситуации. Если гемолиз произошел после взятия крови, то такие образцы следует отбросить, чтобы не получить ложных результатов.

Тесты для оценки сосудистого и тромбоцитарного компонентов гемостаза

Традиционные тесты на исследование сосу­дистого и тромбоцитарного компонентов гемо­стаза, в том числе пробы на резистентность (ломкость) капилляров, пробы на длительность и величину капиллярного кровотечения, под­счет тромбоцитов в камере, изучение размеров тромбоцитов в мазке, визуальные методы на

.

спонтанную и индуцированную агриегацю, хо­рошо известны и представлены во многих по­собиях. В настоящем изложении остановимся только на относительно новых методах, отра­ботанных на новой лабораторной технике, по­ступающей в клинико-диагностические лабора­тории.

Время кровотечения

Время кровотечения - это время от момента нанесения стандартной раны кожи до момента прекращения вытекания крови. Оно характери­зует функциональную активность тромбоцитов и взаимодействие тромбоцитов с сосудистой стен­кой. Время кровотечения не выявляет всех тром-боцитарных нарушений (такого метода вообще не существует), этот скрининговый тест позволя­ет заподозрить тромбоцитопатии различного ге-

неза, болезнь Виллебранда и нарушения проаг-регантных свойств сосудистой стенки. После вы­явления патологии нет необходимости повторять это исследование, нужно использовать более чув­ствительные и специфичные методы. У этого ме­тода есть серьезные недостатки: Метод плохо стандартизуется. Результаты

теста позволяют лишь предположить наличие

тех или иных нарушений.

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Низкая чувствительность. Отсутствие удли­нения времени кровотечения не всегда позво­ляет исключить нарушения тромбоцитарно-го или сосудистого звеньев гемостаза. Низкая специфичность не позволяет одно­значно интерпретировать результаты метода.

Однако это наиболее доступный метод для вы­явления нарушений взаимодействия тромбоцитов с сосудистой стенкой. Кроме того, это дешевый ме­тод, позволяющий заподозрить нарушения соответ­ствующего звена гемостаза и решить вопрос о необ­ходимости дальнейших углубленных исследований.