При отборе проб мешалку выключают!
Раствор, отобранный на анализ, фильтруют через бумажный фильтр. Измеряют оптическую плотность на ФЭКе со светофильтром № 3 в кювете с рабочим объемом 10 мл. Исходя из оптической плотности, по калибровочной кривой находят концентрацию рибофлавина в пробе в мкг/мл. Строят график зависимости высвобождения рибофлавина от времени. По оси абсцисс откладывают время, по оси ординат — концентрацию рибофлавина в мкг/мл.
Таким же образом исследуются таблетки серии «Б». Определяют скорость высвобождения рибофлавина из таблеток обеих серий расчетным способом. Делают выводы о скорости и полноте высвобождения рибофлавина в зависимости от используемых вспомогательных веществ.
Задание № 2. Исследование зависимости степени биологической доступности лекарственного вещества от лекарственной формы в опытах.
Двум группам добровольцев-мужчин в возрасте 20—25 лет вводили по 100мг амидопирина:
1 группа — в суппозиториях (2,5 г), после очистительной клизмы;
2 группа — в порошках, натощак.
Через 6 и 12 часов после начала опыта у испытуемых собирают мочу и проводят количественное определение препарата.
Таблица № 5 - Концентрация амидопирина в моче (в мкг мл)
| № опыта | Суппозитории через | № опыта | Порошки через | ||
| 6 часов | 12часов | 6 часов | 12 часов | ||
| 1. | 104,00 | 10,70 | 6. | 44,85 | 31,93 |
| 2. | 64,66 | 109,00 | 7. | 24,02 | 64,91 |
| 3. | 104,60 | 79,43 | 8. | 91,03 | 46,71 |
| 4. | 38,53 | 52,77 | 9. | 71,78 | 40,37 |
| 5. | 121,90 | 55,67 | 10. | 80,23 | 38,53 |
Подсчитывают значение среднеарифметических величин в каждой серии опытов, проводят статистическую обработку результатов и строят график. Делают выводы о терапевтической эффективности препарата, о роли лекарственной формы и путей введения в фармакокинетике лекарственного вещества.
1.5 ТЕМА №5:Влияние мазевых и суппозиторных основ на биологическую доступность лекарственных препаратов из мазей и суппозиториев.
ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ:Оценка влияния вспомогательных веществ, природы мазевых основ на скорость и степень высвобождения лекарственных веществ из мазей.
ЗАДАЧИ:1.Изучить влияние мазевой основы на скорость и степень высвобождения сульфацила натрия из мазей.
2. Оценить степень высвобождения ЛВ из суппозиториев, приготовленных на различных основах.
3. Оценить степень высвобождения ЛВ из мазей, приготовленных на различных основах.
4. Дать оценку доступности нерастворимой фазы в мазях-суспензиях в зависимости от характера использованных вспомогательных и основообразующих компонентов.
5. Исследовать степень высвобождения препаратов в зависимости от характера сопутствующих лекарственных компонентов в мазях.
6. Изучить влияние мазевых основ на биологическую доступность иодида калия из мазей, приготовленных на различных основах.
ОБОСНОВАНИЕ ТЕМЫ.Современными биофармацевтическими исследованиями установлено большое влияние фармацевтических факторов на терапевтическую активность лекарств в мазях и суппозиториях.
При приготовлении данных ЛФ наиболее важное значение, с точки зрения биофармации, имеют способы введения лекарственных веществ в основы, степень их дисперсности, а также выбор вспомогательных веществ, природа основы. Многочисленными исследованиями доказано, что один и тот же лекарственный препарат может оказывать совершенно различное действие, в зависимости не только от того, каким способом он введен в мазь, но и от того, с какой основой он комбинирован. Так, например, салициловая кислота, применяемая в виде 5% вазелиновой мази, оказывает очень слабое кератолитическое действие и проникает в кровь в незначительном количестве (1,4—4,3 гм% через 3 часа после нанесения мази). Та же 5% салициловая мазь, приготовленная на эмульсионной основе, вызывает выраженный кератолиз и обеспечивает всасывание в кровь значительных количеств салициловой кислоты (10—16 мг% через 3 часа после нанесения мази). Это показывает, что мазевая основа является активным компонентом, принимающим важное участие в фармакодинамике мази. В связи с разными целями назначения мазей возникает необходимость употреблять мазевые основы с различными свойствами.
Основы для невсасывающихся, поверхностно действующих мазей не должны обладать способностью всасывания. Действие этих мазей ограничивается верхним слоем эпидермиса или поверхностью слизистой.
Основы для защитных мазей, применяемые с профилактической целью на различных производствах, должны быстро высыхать и плотно прилегать к поверхности кожи, оставаться на поверхности кожи в течение рабочего времени, не обладать липкостью, не пачкать одежды и легко смываться водой и мылом.
Основы для мазей резорбтивного действия (мази с гормонами, витаминами, антибиотиками) должны обладать способностью глубоко проникать в кожу, достигать кровяного русла и лимфы, легко высвобождать биологические вещества и способствовать их всасыванию.
Естественно, что сочетать разнообразные свойства основ в соответствии с целями назначения мазей в каком-то одном или небольшом числе веществ невозможно. Поэтому в качестве мазевых основ используется большой ассортимент различных по составу и свойствам веществ натурального или искусственного происхождения. Подбор мазевой основы для каждого лекарственного вещества или группы препаратов необходимо проводить экспериментально с учетом высвобождения лекарственных веществ из лекарственной формы.
Важным показателем качества мазей и суппозиториев является способность ЛФ обеспечивать оптимальную биологическую доступность лекарственного вещества. Для этого должны быть оценены способность лекарственного вещества к высвобождению из ЛФ, степень его резорбции, распределение по органам и тканям, метаболизм, экскреция во времени.
О способности лекарственного вещества к высвобождению из мази можно судить по результатам исследования его диффузии. Для этого можно использовать модельные опыты, проводимые in vitro. Одним из этих методов является диффузия через мембрану. Сущность этого метода исследования способности мазей к высвобождению активного ингредиента заключается в том, что между мазью и средой, в которую выделяется лекарственное вещество, помещают полупроницаемую мембрану. Мембраной могут служить целлофановые, силиконовые, коллагеновые, этилцеллюлозные и другие пленки.
В качестве среды, в которую выделяется лекарственное вещество, может быть использована вода, физиологический раствор, раствор Рингера, раствор Рингера-Локка. Количество вещества, диффундированное через мембрану, определяют химическими или физико-химическими методами[3].
Учебный материал
Основными показателями при оценке суппозиториев и мазей являются:
- свойства лекарственного вещества (растворимость, размер частиц),
- характер основы, вспомогательных компонентов,
-температура плавления или скорость растворения,
- способ введения препарата в основу, наличие добавок.
Существуют следующие методы определения скорости перехода лекарственного вещества из лекарственной формы в раствор:
Разделительный метод
Предназначен для пероральных лекарств, суппозиториев и мазей с препаратами, способными растворяться в гидрофобной фазе.
По этому методу используется способность полного перехода высвобождающегося в водной фазе препарата в органический растворитель, образующий один слой в приборе (вода, раствор кислоты хлористоводородной, физиологический раствор и т. д. образует другой слой).
Пробу лекарственной формы помещают в водную фазу. Переход препарата в гидрофобную фазу может осуществляться как естественной конвекцией, так и при периодическом взбалтывании. Через заданный промежуток времени (30 - 120 мин.) воду сливают, а в органическом растворителе определяют содержание препарата.
Метод диализа
Предназначен для пероральных ЛС, суппозиториев, мазей, пластырей и других лекарственных форм с водорастворимыми препаратами.
Обычно в качестве диализной мембраны используют пленки из натуральных или полимерных материалов различной природы (переживающая кожа животных, стенка желудка и кишки, яичная оболочка, целлофан, поливинилхлорид, пленки из ацетата целлюлозы, полиамида и т. д.). В качестве среды, в которую диализирует лекарственное вещество, можно использовать воду, изотонический раствор хлорида натрия, раствор Рингера и т. д. Процесс обычно ведется в термостате при 37°; Аппаратурное оформление может быть различным. В упрощенном случае прибор представляет собой стеклянную трубку длиной 15 см, сечением 10 см2, на один конец которой крепят целлофановую мембрану. Диализную трубку с мембраной опускают на глубину 2 - 3 мм в термостатированный сосуд (химический стакан емкостью 250 мл), содержащий 30 мл очищенной воды (или другой среды). После достижения температуры 37±0,5°С на целлофановую мембрану опускают или равномерно наносят исследуемую лекарственную форму. Отбор проб диализата в каждом случае производят с помощью пипетки через равные интервалы времени с момента начала диализа с немедленным возвращением взятого количества чистого растворителя в диализатор. Объем каждой пробы равен 5 мл. Взятые пробы анализируются химическими или физико-химическими методами.
Оформление результатов
Данные определения вносят в соответствующие таблицы. Строят график, затем подсчитывают общее содержание препарата в объеме диализата. На основании полученных данных делают выводы о зависимости скорости высвобождения препарата от изучаемых факторов. Расчеты ведутся так же, как при методе растворения.
Диффузия в гель
(метод предназначен для мазей, гелей и суппозиториев)
Двухпроцентный агаровый или желатиновый гель готовят на стандартном растворителе (натрия хлорида - 8,9 г, калия хлорида - 0,3 г, кальция хлорида - 0,33 г, воды очищенной до 1000 мл). Приготовленный раствор в количестве 15-20 мл разливают в чашки Петри. В сформировавшемся геле через 24 часа металлическим цилиндром с диаметром примерно 8 мм вырезают диски; в образовавшиеся лунки вносят испытуемые образцы лекарственных форм. Степень высвобождения препарата из лекарственной формы фиксируется по радиусу окрашенной зоны, которая образуется при взаимодействий препарата со специально подобранным индикатором. Индикатор вводится либо в процессе приготовления геля, либо наносится разбрызгиванием на поверхность чашки через определенное время контакта геля с лекарственной формой. Можно также вырезать определенную зону геля и после растворения провести количественное определение. В случае флюоресцирующих препаратов зону их освобождения отмечают при просмотре в УФ - свете. Возможно также использование авторадиограмм и микробиологических тестов.
В качестве модельной среды, оптимально приближающейся по своим свойствам к живой ткани может быть использована система состоящая из равных частей эмульсия прямого и обратного типа. Эмульсия прямого типа состоит из 85 частей вазелина, 10 частей воды очищенной, 5 частей желатозы, эмульсия обратного типа – из 87 частей вазелина, 10 частей воды очищенной, 3 частей эмульгатора Т-2. Эмульсии обоих типов смешивают и вносят в чашки Петри. В центр чашки, в лунку в геле помещают 0,5 г. исследуемых суппозиторных масс. Выдерживают в термостате при 37˚С в течение 48 часов. Измеряют окрашенную зону геля.
Оформление результатов
В дневник заносят результаты измерений зон высвобождения препарата или результаты количественного определения. На основании сравнения результатов выявляют оптимальные технологические варианты.
Метод окрашенных комплексов
Предназначен для мазей с водо- и жирорастворимыми препаратами на эмульсионных основах.
Для выбора оптимальной основы для мазей с водо- и жирорастворимыми компонентами из числа имеющихся в распоряжении эмульсионных систем используют метод окрашенных комплексов. 100 г каждой из выбираемых основ тщательно гомогенизируют с 5 - 10 каплями 2% водного раствора метиленового синего или 5 - 10 каплями 5% масляного раствора судана III. Затем выявляют наиболее интенсивную окраску сравнением с эталонами.
Эталонные растворы готовят методом стандартных серий. Исходными растворами для серии разведений служат 0,02% раствор метиленового синего в воде и 0,02% раствор судана III в вазелиновом масле. Эталонные растворы помещают в одинаковые стеклянные сосуды с непрозрачной задней стенкой. Сравнение производят в отраженном свете.
Таблица 6 - Шкала эталонных растворов
| Индекс эталона | Эталоны синих оттенков | Индекс эталона | Эталоны красных оттенков | |
| Основной раствор + вода в мл. | ||||
| Основной раствор + вазелиновое масло в мл. | ||||
| 1с | 0,5 + 9,5 | 1к | 4 + 36 | |
| 2с | 1,0 + 9,0 | 2к | 8 + 32 | |
| 3с | 1,5 + 8,5 | 3к | 12 + 28 | |
| 4с | 2,0 + 8,0 | 4к | 16+24 | |
| 5с | 2,5 + 7,5 | 5к | 20 + 20 | |
| 6с | 3,0 + 7,0 | 6к | 24+ 16 | |
| 7с | 3,5 + 6.5 ' | 7к | 28+12 | |
| 8с | 4,0 + 6,0 | 8к | 32+8 | |
| 9с | 4,5 + 5,5 | 9к | 36+4 | |
| 10с | 5,0 + 5,0 | 10к | 40+0 |
с — эталоны синих оттенков,
к — эталоны красных оттенков.
Оформление результатов
Результаты соответствия модельных систем тому или иному индексу эталона заносят в дневник. Рекомендации по выбору эмульсионных основ базируются на том, что для водорастворимых препаратов целесообразно использование основ с более высоким индексом шкалы эталонов по метиленовому синему, для жирорастворимых — по судану III.
Метод микроскопии
Предназначен для рационального выбора диспергирующих сред и основ для мазей - суспензий на гидрофобных основах.
Метод позволяет сделать обоснованный выбор основообразующих и вспомогательных компонентов, а также их сочетаний. Кроме того, метод позволяет дать качественную оценку готовым мазевым системам по доступности нерастворимой фазы внешней гидрофильной среде.
Пробы мазей в количестве 5 - 10 г готовят с содержанием твердой фазы 5%. Первый этап приготовления проб заключается в нанесении на поверхность частиц первичного контактирующего слоя. В качестве последнего используют как сами основы, так и изучаемый ассортимент вспомогательных компонентов. Нанесение контактирующих слоев проводят при растирании навески препарата в их среде. Затем в ступку вводится рассчитанное количество расплавленной основы и смесь гомогенизируют до охлаждения. К приготовленной таким образом пробе добавляют равное количество внешней гидрофильной среды — 0,1% водного раствора метиленового синего. Проводят тщательное смешение, затем отбирают микропробы. Для достоверности отбирают 6 микропроб по 3 мг каждая. После переноса их на предметное стекло и покрытия покровным путем слабого давления, чтобы не нарушать систему, получают слои для просмотра. Просмотр ведется при увеличении 15x40 в 2- 3 точках микропробы. Возможно образование 4-х типов микроскопических полей:
I - частицы окрашены и имеют голубую гидрофильную оболочку;
II - частицы окрашены, но, не имея гидрофильной оболочки, распределены в гидрофобной основе;
III - частицы не окрашены, но имеют гидрофильную оболочку;
IV - частицы не имеют окраски и гидрофильной оболочки и распределены в основе.
Типы полученных микроскопических полей схематично изображают в дневнике. Делают вывод о рациональном выборе вспомогательных и основообразующих компонентов для каждого конкретного сочетания.
Оформление результатов
Наибольшего эффекта следует ожидать от систем I, II, III, в которых водная фаза имеет доступ к частицам препарата. Образование типа IV свидетельствует, что использованное сочетание, вспомогательного и основообразующего компонента не обеспечивает доступности данного препарата.
Вопросы для обсуждения:
1. Мази как лекарственная форма. Классификация мазей в зависимости от степени дисперсности лекарственного вещества и характера его распределения в основе.
2. Требования к мазевым основам.
3. Классификация мазевых основ.
4. Фармацевтические факторы, оказывающие влияние на фармакологическую активность препаратов в мазях.
5. Влияние физико-химического состояния лекарственных веществ на их активность в мазях.
6. Зависимость терапевтической эффективности лекарственных веществ в мазях от технологического процесса приготовления мазей.
Необходимые материалы и аппаратура:
1. Сульфацил натрий, вазелин, ланолин безводный, эмульгатор Т-2, вода очищенная.
2. Весы, разновес.
3. Выпарительные чашки—10 шт.
4. Ступки с пестиком — 14 шт.
5. Водяная баня.
6. Банки мазевые — 45 шт.
7. Колбы термостойкие — 5 шт.
8. Предметные стекла — 40 шт.
9. Цилиндры на 50 мл — 5 шт.
10.Цилиндры на 10 мл — 5 шт.
11.Шпатели — 5 шт.
12.Целлулоидные пластинки (скребочки) — 15 шт.
Практическая часть занятия:
Задание № 1.Влияние мазевой основы на скорость и степень высвобождения сульфацила натрия из мазей.
Практическая работа заключается в приготовлении 10% мази сульфацила натрия на различных основах в количестве 30,0 на каждой основе ипоследующих оценке их качества.
Составы мазей
на основе № 1 на основе № 2
сульфацила натрия - 10,00 сульфацила натрия - 10,0
вазелина - 90,0 вазелина - 72,0
ланолина - 18,0
на основе № 3
сульфацила натрия - 10,0
вазелина - 54,0
эмульгатора Т – 2 - 9,0
воды очищенной - 27,0
Технология мазей
Мазь на основе № 1 готовят как мазь суспензионного типа, учитывая, что водорастворимый сульфацил натрия входит в состав мази в большом количестве. В ступке растирают сульфацил натрия с частью расплавленного вазелина, добавляют остальной вазелин. Получена суспензионная мазь на углеводородной основе.
Мазь на основе № 2 готовят как мазь эмульсионного типа. Указанный в составе водный ланолин необходимо заменить на ланолин безводный (12,6 г), а воду (5,4 мл) использовать для растворения сульфацила натрия. В ступке растворяют сульфацил натрия в горячей воде, эмульгируют ланолином безводным и добавляют вазелин. Получена эмульсионная мазь на гидрофильно - липофильной (абсорбционной) основе.
Мазь на основе № 3 готовят по следующей технологии. В выпарительной чашке на водяной бане сплавляют эмульгатор Т-2 свазелином.
В ступке растворяют сульфацил натрия в горячей воде очищенной (27 мл), входящей в состав основы. К раствору препарата добавляют частями горячий сплав, тщательно перемешивая до полного эмульгирования раствора. Получена эмульсионная мазь на эмульсионной основе типавода в масле.
Качество приготовленных мазей оценивают по их однородности согласно методике ГФХ. Для определения однородности берут 4 пробы мази по 0,02—0,03 г, помещают их по 2 пробы на предметное стекло, покрывают вторым предметным стеклом и плотно прижимают до образования пятен диаметром около 2 см. При рассмотрении полученных пятен невооруженным глазом (на расстоянии около 30 см от глаз) в 3 из 4 проб не должно обнаруживаться видимых частиц. Если частицы обнаруживаются в большем числе пятен, определение проводят повторно на 8 пробах. При этом допускается наличие видимых частиц не более чем в двух пятнах. Необходимо сделать вывод об однородности каждой из 3-х мазей. Приготовленные мази сохраняют до следующего занятия для оценки для оценки скорости высвобождения препарата из мазей.
Задание №2. Дать сравнительную оценку степени высвобождения препаратов из суппозиториев, приготовленных на различных основах.
1. Возьми: Новокаина солянокислого 0,1
Масла какао достаточное количество, чтобы получился ректальный суппозиторий весом 3,0
Дай таких доз N 6
Обозначь: по 1 свече при болях.
2. Возьми: Новокаина 0,1
Бутирола достаточное количество, чтобы получился ректальный суппозиторий весом 3,0
Дай таких доз N 6
Обозначь: по 1 свече при болях.
3. Возьми: Возьми: Новокаина 0,1
Основы мыльно - глицериновой достаточное количество, чтобы получился ректальный суппозиторий весом 3,0
Дай таких доз N 6
Обозначь: по 1 свече при болях.
Свечи приготовить методом выливания. Высвобождение препарата определить диализом через целлофановую мембрану. Объем диализата 25 мл, объем пробы 3 мл. Интервал взятия проб каждые 10 минут в течение 1 часа.
Построить график и сделать вывод о влиянии характера основы на степень высвобождения препарата.
Задание №3. Дать сравнительную оценку степени высвобождения препаратов из суппозиториев с различным способом введения препарата в основу.
1. Возьми: Новокаина 0,1
Масла какао достаточное количество, чтобы получился шарик весом 4,0
Дай таких доз N 6
Обозначь: по 1шарику при болях.
Вагинальные суппозитории приготовить методом выкатывания:
a) новокаин ввести в основу по типу суспензии;
б) новокаин ввести в основу по типу эмульсии, растворив его в нескольких каплях воды и заэмульгировав ланолином.
Условия опыта - см. задание №2.
Построить график и сделать выводы о влиянии дисперсной системы на степень высвобождения препарата.
Задание №4. Дать сравнительную оценку степени высвобождения препаратов из мазей, приготовленных на различных основах.
1. Возьми: Кислоты салициловой 0,1
Вазелина 10,0
Смешай, дай, обозначь: наносить на пораженные участки тела 2 раза в день.
2. Возьми: Кислоты салициловой 0,1
Жира свиного 10,0
Смешай, дай, обозначь: наносить на пораженные участки тела 2 раза в день.
3. Возьми: Кислоты салициловой 0,1
Вазелина 6,0
Эмульгатора Т-2 1,0
Воды очищенной 3 мл
Смешай, дай, обозначь: наносить на пораженные участки тела 2 раза в день.
Скорость высвобождения салициловой кислоты из мазей определить путем диализа в желатиновый гель с добавлением в него раствора хлорида окисного железа. Проба мази — 1г. Радиус окрашенной зоны в мм измерить через 3 часа. Зарисовать схематично результат эксперимента. Сделать вывод о влиянии характера основы на степень высвобождения препарата из мазей.
Задание №5. Дать оценку доступности нерастворимой фазы в мазях-суспензиях в зависимости от характера использованных вспомогательных и основообразующих компонентов.
1. Возьми: Дерматола 0,5
Вазелина 10,0
Смешай, дай, обозначь: наносить на пораженные участки тела 2 раза в день.
2. Возьми: Ксероформа 0,5
Вазелина 10,0
Смешай, дай, обозначь: наносить на пораженные участки тела 2 раза в день.
3. Возьми: Цинка окиси 0,5
Вазелина 10,0
Смешай, дай, обозначь: наносить на пораженные участки тела 2 раза в день.
4. Возьми: Серы 0,5
Вазелина 10,0
Смешай, дай, обозначь: наносить на пораженные участки тела 2 раза в день.
Каждую мазь приготовить, используя в качестве диспергирующих средств воду, этанол, глицерин, вазелиновое и персиковое масла. Доступность препаратов внешней гидрофильной среде определить методом микроскопии. Зарисовать и описать микроскопические поля. Сделать вывод о целесообразности использования тех или иных вариантов конкретно для каждого препарата.
Задание №6. Дать оценку степени высвобождения препаратов в зависимости от характера сопутствующих лекарственных компонентов.
1. Возьми: Кислоты салициловой 0,2
Крахмала 1,0
Основы 10,0
Смешай, дай, обозначь: наносить на пораженные участки тела 2 раза в день.
2. Возьми: Кислоты салициловой 0,2
Висмута субнитрата 1,0
Основы 10,0
Смешай, дай, обозначь: наносить на пораженные участки тела 2 раза в день.
3. Возьми: Кислоты салициловой 0,2
Глины белой 1,0
Основы 10,0
Смешай, дай, обозначь: наносить на пораженные участки тела 2 раза в день.
Каждую мазь приготовить с использованием трех основ: вазелина, свиного жира, эмульсионной основы (вазелина 60,0, воды 30,0, эмульгатора Т2 10,0). Высвобождение препарата определить методом диффузии в гель. (индикатор—хлорид железа III). Время диффузии 24 часа.
Зарисовать результат диффузии, измерить радиус окрашенной зоны. Сделать вывод о влиянии добавок других препаратов на высвобождение салициловой кислоты из основ различного характера.
Задание № 7. Влияние мазевых основ на биологическую доступность иодида калия из мазей, приготовленных на различных основах.
Биофармацевтической оценке подвергали 10% мази с иодидом калия, приготовленные на исследуемых основах (основа №1 и основа № 2), содержащих гидрированное подсолнечное масло. Стандартной является 10% мазь иодида калия, приготовленная на основе, содержащей вазелин. Все исследуемые основы эмульсионного типа.
Состав мазевых основ:
Основа № 1
Гидрированное подсолнечное масло - 64,0
Пентол - 5,0
Глицерин - 5,0
Вода очищенная - 27,0
Основа № 2:
Гидрированное подсолнечное масло - 48,0
Сорбитанолеат - 7,0
Глицерин - 5,0
Вода очищенная - 40,0
Контрольная основа
Вазелин - 25,0
Ланолин безводный - 5,0
Вода очищенная - 30,0
Скорость высвобождения калия иодида из мазей и всасываемость его через кожу определяли в опытах in vivo. Исследование мазей проводили на кроликах - самцах, отличающихся по весу не более, чем на 200 гр. У всех животных предварительно на участке спинки 4X5 см тщательно выстригали шерсть. На подготовленный участок кожи наносили 5 г мази. До начала опыта и через определенные промежутки времени после нанесения мази на кожу из ушной вены кроликов брали кровь, в которой определяли концентрацию ионов калия методом пламенной фотометрии. С каждой мазью проводили по 10 исследований. Результаты опытов приведены в таблице 7.
Таблица 7 – Результаты опытов по определению содержания ионов калия в плазме крови кроликов
| Основа | Содержание ионов калия (мг%) в плазме крови кроликов через (час) | |||||||
| 0.5 | ||||||||
| Основа № 1 | 19.62 | 22,27 | 26,60 | 30.76 | 29,56 | 28,40 | 25,20 | 20,00 |
| Основа № 2 | 19.10 | 22,30 | 24,42 | 26,91 | 25,68 | 24,60 | 23,20 | 21,00 |
| контрольная | 19,18 | 19.50 | 19,90 | 21,20 | 24,28 | 26,00 | 23,80 | 20,30 |
Как видно из полученных данных, по содержанию ионов калия в плазме крови можно судить о скорости всасывания мазей лекарственного вещества и о накоплении его в крови.
Изменение содержания ионов калия в плазме крови было обнаружено уже через 1/2 часа после нанесения на кожу кроликов мазей на основах на основах № 1 и № 2. В последующие 2 часа происходит постепенное нарастание концентрации ионов калия, а к 3 часу она достигает максимальной величины и к 6 часу она остается на том же уровне. Это свидетельствует о том, что основы на подсолнечном гидрогенизате способны не только обеспечить быстрое всасывание препарата из мази, но и длительное сохранение его содержания на высоком уровне.
К 10-ти часам нахождения мази на коже отмечается снижение концентрации калия в плазме крови кроликов, которое становится значительным к 14-ти часам и происходит, по-видимому, вследствие того, что процесс выведения ионов калия из кровяного русла преобладает в это время над процессом поступления их из мазей. Через 24 часа содержание ионов калия восстанавливается до нормального.
Данные, полученные для мазей на контрольной основе, обнаруживают несколько иную динамику резорбции препаратов. Увеличение концентрации ионов калия в кровяной плазме наблюдается только через 3 часа после применения мазей. Протекающее в дальнейшем постепенное увеличение содержания ионов калия приводит к максимальной величине их концентрации только лишь через 10 часов. К 14-ти часам происходит снижение концентрации ионов и к 24 часам она близка к нормальной.
Совершенно очевидно, что всасывание калия иодида из мазей на контрольной основе происходит значительно медленнее, чем на основах с гидрированным подсолнечным маслом. Применение в эмульсионных основах подсолнечного гидрогенизата в сочетании с эмульгаторами: пентолом и сорбитанолеатом приводит к увеличению скорости всасывания препарата в 3—6 раз по сравнению с вазелиновой основой, стабилизированной ланолином.
Данные приведенные в таблице, переносятся в дневники и используются для построения графика. Дается оценка результатов исследования по скорости высвобождения, степени всасываемости препарата, пиковым концентрациям, быстроте накопления препарата в крови и его выделения из организма. Делают выводы о влиянии состава мазевых основ на биологическую доступность препарата из мазей.
1.6 ТЕМА №6: Влияние мазевых основ на биологическую доступность лекарственных препаратов из мазей (продолжение). Моделирование лекарственных форм пролонированного действия и препаратов с ускоренным высвобождением препаратов.
ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ:Экспериментальная оценка влияния вспомогательных веществ на скорость и степень высвобождения сульфацила натрия из мазей, приготовленных на разных основах.
ЗАДАЧИ:1.Определить скорость и степень высвобождения сульфацила натрия из мазей, приготовленных на разных основах.
2.Изучить влияние ускорителей всасывания на степень высвобождения лекарственных веществ из лекарственных форм.
3. Изучить влияние ПАВ на степень высвобождения лекарственных веществ из лекарственных форм.
Учебный материал
Наиболее распространенным методом изучения биодоступности и высвобождения ЛВ является метод диализа. Эффективное использование этого метода определяется главным образом выбором подходящей мембраны. Обычно в качестве диализной мембраны используют пленки из полимерных материалов различной природы (целлофан, поливинилхлорид, полиамид, ацетат целлюлозы). Недостатком этих мембран является то, что они синтетические, в основном это – полимеры углеводов и их производных, в то время как биологические мембраны состоят из липидов и белков. Описано применение в качестве диализных мембран пленок из натуральных материалов. Метод применения подобных диализных мембран носит название метода изолированных органов. Указанные мембраны наиболее близки к предлагаемым и выбраны за прототип. Но несмотря на их естественную природу, у биологических мембран есть недостатки в использовании: а) для выделения подобных мембран требуется производить забой животных, б) выделенные мембраны имеют очень маленькую рабочую поверхность, в) мембраны из-за содержащихся в них липидов и белков очень быстро подвергаются процессам окисления, гниения; продукты разложения могут очень сильно повлиять на результаты исследования. Метаболиты мембран могут образовывать продукты взаимодействия с исследуемыми лекарственными веществами. Поэтому натуральные мембраны должны быть всегда свежевыделенными; г) трудоемкость в отделении мембраны от мышечного кожного слоя. В Пятигорской фармацевтической академии в 2001 г. был изобретен способ создания мембран близких по свойствам к биологическим мембранам, с длительным сроком хранения и использования, с большой рабочей поверхностью, доступностью изготовления, исключением использования животных. Способ осуществляется путем приготовления 6% раствора лецитина в кипящем 95мас.% спирте этиловом, погружения мелкопористых бумажных фильтров «синяя лента» диаметром 5-20 см в раствор лецитина и выдерживания в нем в течение 48 ч.; удаления избытка спирта от фильтров дэаэрацией. При погружении бумажных фильтров в спиртовой раствор лецитина фильтры равномерно пропитываются раствором, приобретая светло-желтую окраску. Полученные мембраны не подвергаются окислению, разрушению, гниению и другим процессам; они, как обычные бумажные фильтры, могут храниться и применяться длительное время. Кроме того, они могут быть изготовлены непосредственно перед проведением исследования. Для диализа различных объемов растворов можно подобрать фильтры с различной рабочей поверхностью. При этом способ отличается доступностью и простотой: лецитин, предлагаемый для получения мембран, широко используется при производстве шоколада, маргарина; не требуется сложной аппаратуры. Данный способ получения моделей биологических мембран поясняется следующими примерами конкретного выполнения:
ПРИМЕР №1. В круглодонную колбу со шлифом вместимостью 250 мл, соединенную с обратным холодильником, вносят 100 г 95 мас.% спирта этилового. Содержимое колбы нагревают на кипящей водяной бане до кипения спирта (температура кипения 78˚С), затем в колбу вносят 6 г лецитина и продолжают нагревать до растворения лецитина. Колбу с содержимым охлаждают и раствор лецитина желтого цвета переливают в чашку Петри; в раствор погружают 10 бумажных фильтров «синяя лента» диаметром 10 см., выдерживают в течение 48 ч. Затем фильтры вынимают и остатки растворителя удаляют в вытяжном шкафу. Целевой продукт - мембраны – представляет собой фильтры с воскообразной поверхностью светло-желтого цвета; окраска равномерная по всей поверхности. Степень диализа через полученную мембрану 1% раствора альгината натрия составляет 0,580; 1% раствора свекловичного пектина 0,848 (патент №2202835)
ПРИМЕР №2. В колбу со шлифом вместимостью 250 мл., соединенную с обратным холодильником, вносят 80 г. 90 масс. % спирта этилового; содержимое колбы нагревают на кипящей водяной бане до температуры 60˚С (контролируя по термометру), затем в колбу вносят 4 г. лецитина и нагревают до растворения лецитина (5% раствор). Колбу с содержимым охлаждают и раствор лецитина желтого цвета переносят в чашку Петри, в раствор погружают 10 бумажных фильтров «синяя лента» диаметром 5 см., выдерживают в течение 72 ч. Затем фильтры вынимают и удаляют остатки спирта деаэрацией в вытяжном шкафу.
Степень диализа через полученную мембрану 1% раствора альгината натрия составляет 0,595; 1% раствора свекловичного пектина 0,867.
ПРИМЕР №3. В колбу со шлифом вместимостью 250 мл., соединенную с обратным холодильником, вносят 130 г. 80 масс. % спирта этилового; содержимое колбы нагревают на кипящей водяной бане до температуры 40˚С (контролируя по термометру), затем в колбу вносят 5,2 г. лецитина и нагревают до растворения лецитина (4% раствор). Колбу с содержимым охлаждают и раствор лецитина желтого цвета переносят в кристаллизатор; в раствор погружают 10 бумажных фильтров «синяя лента» диаметром 20 см., выдерживают в течение 36 ч. Затем фильтры вынимают и удаляют остатки спирта деаэрацией в вытяжном шкафу.
Степень диализа через полученную мембрану 1% раствора альгината натрия составляет 0,621; 1% раствора свекловичного пектина 0,888.
Из оставшихся спиртовых растворов регенерируют спирт отгонкой.
Моделирование лекарственных форм пролонгированного действия в границах заданного диапазона.
Лекарственные формы, обеспечивающие более длительный период терапевтического действия заключенного в них лекарственного вещества, чем обычные, носят название «лекарственные формы продленного действия». Они должны высвобождать дозу лекарственного вещества непрерывно в течение определенного периода, сохраняя, таким образом, постоянный оптимальный уровень этого вещества в организме без повышения и понижения его концентрации.
Лекарственные формы этой группы могут проявлять 1) повторное или 2) поддерживающее действие. В первом случае дозы активного вещества высвобождаются через определенные промежутки времени (рис. 4)
t
Рис. 4. Лекарственная форма повторного действия
Лекарственные формы поддерживающего действия более эффективны, т. к. обеспечивают достаточно постоянную концентрацию лекарственного вещества на его терапевтическом уровне без выраженных экстремумов (рис. 5), как это наблюдается в лекарственных формах предыдущей группы. Существует три основных принципа увеличения времени пребывания лекарственного вещества в организме:
1) уменьшение скорости выделения препарата из организма;
2) замедление его биотрансформации;
3) замедление всасывания.
Последний из них считается наиболее индифферентным и основан на использовании специальных технологических приемов. При этом используются различные принципы воздействия на препарат:
1. Повышение вязкости раствора;
2. Замена раствора вещества его микрокристаллическими суспензиями путем использования жидкой фазы, в которой препарат не растворяется;
3. Покрытие оболочками кристаллических частиц лекарственных веществ, гранулятов, таблеток;
Рис. 5. Лекарственная форма поддерживающего действия
4. Смешивание лекарственных препаратов с веществами, замедляющими всасывание;
5. Использование нерастворимых каркасов (основ);
6. Микрокапсулирование;
7. Использование мембран;
8. Иммобилизация в липосомах;
9. Адсорбция на ионитах, активированных углях, алюмосиликатах, коллагене, синтетических полимерах и т. д.;
10.Использование методов иммобилизации — химическое (ковалентное) связывание с полимерным носителем, образование труднорастворимых комплексов, труднорастворимых солей, эфиров и т. д.
Для определения влияния ВВ на скорость высвобождения мексидола из полимерной композиции трансдермального пластыря, а также моделирование процесса высвобождения также используют метод диализа через мембрану. В качестве вспомогательных веществ в технологии ТТС использовали поливинилпирролидон высокомолекулярный, 1,2-пропиленгликоль, спирт этиловый 95%. Использовать мембрану по свойствам структуре близкую к натуральным мембранам, с длительным сроком хранения и использования, с большой рабочей поверхностью. Мембраны получают путем приготовления 6% раствора лецитина (БАД «Наш лецитин», г. Краснодар) в кипящем 95мас. % спирте этиловом, путем погружения мелкопористых бумажных фильтров «синяя лента» диаметром 15см в раствор лецитина и выдерживания в нем в течение 48 часов. В качестве среды для диализа используют воду очищенную (50мл). Процесс проводят при температуре 37±0,5°C. Отбор проб диализата (3,0мл) осуществляют через 30 минут, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 18, 24, 48, 72 часа с немедленным возвращением в диализат взятого объема растворителя. В воде очищенной под воздействием температуры мексидол гидролизуется с образованием продуктов, имеющих два максимума поглощения при 248±2нм и 325±3нм в диапазоне волн 240 – 340нм. Аналогичная картина наблюдается при добавлении фосфатного буфера (рН 7,4). Мексидол стабилен в 0,01М растворе кислоты хлористоводородной. Поэтому далее 3,0 мл диализата помещают в мерную колбу на 50,0мл и доводят до метки 0,01М раствором кислоты хлористоводородной. Полученное разведение анализируют спектрофотометрически в диапазоне волн 240 – 340нм. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре СФ 2000 – 02 в максимуме поглощения (297±3нм). Толщина слоя 10мм. Параллельно измеряют плотность контрольного образца. Раствор сравнения – 0,01М раствор кислоты хлористоводородной.
Моделирование лекарственных форм с ускоренным высвобождением препаратов
К одному из основных направлений ускорения действия лекарственных веществ в лекарственных формах относится включение в них ускорителей резорбции (тензидов), ПАВ, использование процесса солюбилизации. Эти принципы воздействия открывают новые возможности использования многих лекарственных препаратов, обеспечивая лучшую смачиваемость их поверхности и контакт с тканями организма, значительное влияние на мембранную проницаемость кожных покровов и слизистых оболочек, повышение растворимости или более высокую степень дисперсности, связанную с улучшением резорбции.
Изускорителей резорбции широко известны диметилсульфоксид (ДМСО), диметилформамид (ДМФА), диметилацетамид (ДМАА), моноэтиловый эфир этиленгликоля, этиловый эфир, ацетон, хлороформ, скипидар, вода, полипропиленгликоль и др. соединения.
Поверхностно-активные вещества,независимо от их химической природы по способности к электролитической диссоциации, обычно подразделяют на четыре основные группы: анионактивные (мыла, сульфированные спирты, натрий лаурилсульфат, натриевые соли додецил и стеарилсульфатов, эмульгатор № 1 –смесь высокомолекулярных спиртов кашалотового жира с Na солью их сульфоэфиров); катионактивные(соли четвертичных аммониевых оснований, длинноцепочные алкиламины); неионогенные (спены 20, 40, 60, 65, 80, 85—монолаурат, монопальмитат, моностеарат, тристеарат, моноолеат и триолеат сорбитана, твины 20, 21, 40, 60, 61, 80, 81, 85 — производные полиоксиэтилена сорбитанмонолаурата, монопальмитата, моностеарата, моноолеата, триолеата, эмульгаторы Т-1 и Т-2, монопальмитат и др. производные сахарозы; амфотерные (производные длинноцепочных аминокислот и аминофенолов).
Ускорение действия лекарственных веществ в случае применения ПАВ объясняется главным образом их свойством, адсорбируясь на поверхности раздела гидрофильной и гидрофобной фаз, снижать избыток межфазной поверхностной энергии. Это обеспечивает их эмульгирующие, диспергирующие и др. свойства, повышение абсорбции препаратов.
Для осуществления процесса всасывания лекарственного вещества необходимым условием является его растворимость. Одним из способов повышения растворимости препаратов является их солюбилизация.Солюбилизацией или коллоидным растворением называется самопроизвольный переход враствор нерастворимых или малорастворимых соединений под действием малых добавок к растворителю поверхностно-активных веществ.
Согласно современным представлениям, солюбилизация водонерастворимых олеофильных органических веществ заключается в растворении их во внутренней части (углеводородных ядрах) мицелл ПАВ. При этом устанавливается равновесное распределение солюбилизата между двумя жидкими фазами—дисперсионной средой и коллоидной фазой - мицеллами. Способы включения молекул солюбилизата в мицеллы могут быть разными для веществ различной природы. Это либо хаотическое расположение молекул нерастворимого вещества между цепями молекул ПАВ (углеводороды), либо параллельная ориентация молекул того и другого компонента с обращением полярных групп в водную фазу (спирты, амины), либо закрепление молекул солюбилизата на поверхности мицелл ПАВ внутри беспорядочно изогнутых цепей (фенол), либо проникновение молекул солюбилизата во внутренние мицеллярные пространства между слоями гидрофобных цепей с увеличением расстояния между ними.
Коллоидное растворение протекает довольно медленно. Для достижения равновесия требуется контакт масляной фазы с водным раствором ПАВ длительное время (не менее суток для жидких веществ). Встряхивание и особенно повышение температуры до 50—60°С может ускорить достижение равновесия, снизив экспозицию до 20—30 минут.
Вопросы для обсуждения:
1. Влияние природы и состава мазевых основ на биологическую доступность лекарственных веществ из мазей.
2. Методы оценки способности мази к высвобождению лекарственных веществ в опытах in vitro.
3. Исследование биологической доступности лекарственных веществ, наносимых на кожу в виде мазей в опытах in vivo
4. Основные направления в области совершенствования технологии и улучшении качества лекарственной формы мази
Необходимые материалы и аппаратура:
1. Термостат.
2. Стаканы и трубки для диализа.
3. Целлофановая мембрана, картон.
4. Пробирки.
5. Термометр.
6. Пипетки на 1 мм — 3 шт.
7. 0,5% раствор нитрата натрия.
8. 0,8% раствор хлористоводородной кислоты.
9. Щелочной свежеприготовленный раствор β-нафтола.
10.Вода очищенная.
11.ФЭК.
12.Разновес, весы.
Практическая часть занятия:
Задание №1.Определение скорости и степени высвобождения сульфацила натрия из мазей, приготовленных на разных основах.
Определяют скорость и степень диффузии сульфацила натрия из мазей, приготовленных на занятии № 5, в опытах in vitro, основанных на диализе препарата из мазей через полупроницаемую мембрану с последующим количественным определением содержания препарата в диализате.
Диализ осуществляют в приборе, изображенном на рисунке, состоящем из наружного стеклянного стакана, в который помещен внутренний сосуд без дна. Дном внутреннего сосуда служит целлофановая пленка. На крышке прибора имеется отверстие для забора проб диализата пипеткой. На целлофановую пленку внутреннего сосуда наносят ровным слоем 5 V мази и помещают его в наружный стакан, в который предварительно наливают 25 мл воды очищенной, подогретой до 32°С. Внутренний сосуд погружают в воду на глубину не более 2 мм. Прибор помещают в термостат при температуре 32°С. Через 30, 45 и 60 мин из стакана пипеткой забирают по 1 мл диализата, а в стакан добавляют по 1 мл воды очищенной. Содержание препарата в диализате определяют фотоколориметрически по методике, в основе которой лежит реакция диазотирования. В пробирку емкостью 20 мл к 1 мл диализата добавляют 0,5 мл 0,5% раствора нитрита натрия, 0,1 мл 0,8% раствора хлористоводородной кислоты и через некоторое время 0,1 мл свежеприготовленного щелочного раствора ß-нафтола и 9,3 мл воды очищенной. Раствором сравнения служит вода очищенная, в которую добавлены все указанные реактивы в тех же количествах. Оптическую плотность раствора измеряют на фотоэлектроколориметре в кювете с толщиной слоя 10 мм при зеленом светофильтре № 5. По найденным значениям оптической плотности, пользуясь калибровочным графиком, находят концентрацию препарата. Если концентрация препарата слишком велика и значения оптической плотности не укладываются в шкалу, диализат разбавляют.
По результатам исследования строят график зависимости концентрации препарата в диализате в мг/мл от времени диализа. Рассчитывают константы скорости высвобождения сульфацила натрия из мазей и делают заключение об их качестве по тесту высвобождения, если известно, что мазь хорошего качества должна высвобождать не менее 20% препарата за 2 часа.
Анализируя полученные результаты по графику, оценивают скорость высвобождения, степень диффузии препарата, пиковые концентрации его в диализатах из каждой основы. Делают вывод о влиянии мазевых основ на биологическую доступность сульфацила натрия из мазей, приготовленных на эмульсионной, адсорбционной и углеводородной основах.
Задание №2. Дать оценку степени высвобождения лекарственных веществ из лекарственных форм с добавками ускорителей всасывания.
1. Возьми: Натрия салицилата 0,2
Ланолина 3,0
Вазелина 24,0
Ускорителя всасывания 3,0
Смешай, дай, обозначь: наносить на пораженные участки тела 2 раза в день.
Пробы мазей приготовить с использованием в качестве ускорителя всасывания: а) воды; б) этанола; в) скипидара; г) ДМСО. Провести диализ через целлофановую мембрану. Навеску каждого образца мазей – 2,0; среда для диализа – 30 мл воды очищенной; экспозиция – 20 мин., 40 мин., 60 мин., проба на анализ – 5 мл.
Рассчитать количество высвободившегося препарата в каждом из образцов мазей за одинаковый промежуток времени. Определить оптимальный вариант прописи с точки зрения ускоренного высвобождения препарата.
2. Возьми: Новокаина 2,0
Ланолина 3,0
Вазелина 24,0
Ускорителя всасывания 3,0
Смешай, дай, обозначь: наносить на пораженные участки тела 2 раза в день.
Провести исследования аналогично предыдущим. Сделать выводы о влиянии характера тензида и природы действующих веществ на процесс высвобождения последних.
Задание №3. Дать оценку степени высвобождения лекарственных веществ из лекарственных форм с добавками ПАВ.
1. Возьми: Кислоты салициловой 10,0
Вазелина 90,0
Смешай, дай, обозначь: наносить на пораженные участки тела 2 раза в день.
2. Возьми: Кислоты салициловой 10,0
Вазелина 54,0
Воды 27 мл
Эмульгатора Т-2 9,0
Смешай, дай, обозначь: наносить на пораженные участки тела 2 раза в день.
Провести диализ через целлофановую мембрану. Навески образцов мазей по прописям №1 и №2 – 2,0; среда для диализа 50 мл 0,05% раствора FeCl3, экспозиция – 20 мин, 40 мин, 60 мин.
Колориметрически по калибровочной кривой рассчитать количество высвободившегося препарата в обоих образцах мазей. Определить оптимальный вариант прописи с точки зрения ускоренного высвобождения препарата.
1.7 ТЕМА №7:Влияние вспомогательных веществ (вида растворителя) на длительность нахождения лекарственного вещества в тканях глаза.
ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ:Экспериментальная оценка пролонгирующих свойств растворов натрий-карбоксиметилцеллюлозы (Na-КМЦ).
ЗАДАЧА:1. Определить время контакта полимерного растворителя Na-КМЦ с тканями глаза.
ОБОСНОВАНИЕ ТЕМЫ. Современный подход к проблеме разработки состава глазных капель и их технологии обязательно предполагает всестороннее исследование всех биофармацевтических аспектов получения и назначения глазных капель. Пролонгирование действия лекарственных веществ в глазу теснейшимобразом связано с одним из факторов биофармации «Природа и количество вспомогательных веществ». В настоящее время этот вопрос решается введением в глазные капли таких вспомогательных веществ, которые удлиняют срок терапевтического действия основного лекарственного вещества (поливиниловый спирт, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза и др.). Исходя из принципов биофармации, назначение лекарства и его приготовление должны базироваться на строго научном подходе, исключающем произвольный выбор вспомогательных веществ. При изучении пролонгирующих растворителей для глазных капель важно установить степень высвобождения лекарственного вещества из полимерного раствора, прохождения этого вещества через биологические мембраны и накопления в тканях и органах. Активная роль вспомогательных веществ в процессах высвобождения и всасывания лекарственных препаратов легко иллюстрируется в модельных опытах.
Вопросы для обсуждения:
1. Глазные капли как лекарственная форма. Требования, предъявляемые к глазным каплям, их обоснование.
2. Проблема пролонгирования действия лекарственных веществ в лекарственных формах для глаз. Пути испособы пролонгации.
3. Ассортимент пролонгаторов для глазных капель: метилцеллюлоза, поливиниловый спирт, полиакриламид, полиэтиленгликоли и др.
4. Общие вопросы стабильности и стабилизации лекарств.
5. Сроки годности лекарств и их значение для лекарственного обеспечения. Документы, нормирующие и определяющие срок годности.
6. Общие положения и порядок определения срока годности лекарственных средств методом длительного хранения.
7. Определение срока годности лекарственных средств на основе метода «ускоренного хранения».
Необходимые материалы и аппаратура:
1. Весы, разновес.
2. Мерные цилиндры или мензурки на 100 мл — 3 шт.
3. Флаконы на 100 мл — 3 шт.
4. Стеклянные палочки — 3 шт.
5. Стеклянный вискозиметр —1 шт.
6. Штатив металлический — 1 шт.
7. Чашки Петри — 2 Шт.
8. Фильтровальная бумага, ножницы.
9. Секундомер — 1 шт.
10.Пенициллиновые флаконы — 10 шт.
11. Пикнометры — 3 шт.
12. Рефрактометр —1 шт.
13. Пипетка на 10 мл — 2 шт.
14. Термометр —1 шт.
14. Карбоксиметилцеллюлозы натриевая соль.
15. Сульфацил натрий.
16. Набор реактивов для проведения реакции диазотирования.
17. Хлорид цинка, диметилглиоксим, этиловый спирт.