Сучасні методи діагностики сказу
ДІАГНОСТИЧНА СТРАТЕГІЯ, ПРЕВЕНТИВІЗАЦІЯ ТА ПРОГРАМА ВИКОРЕНЕННЯ СКАЗУ
МЕТОДИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ
ДО ПРОВЕДЕННЯ ЛАБОРАТОРНИХ РОБІТ З ДИСЦИПЛІН
«ІНФЕКЦІЙНІ ХВОРОБИ ХУТРОВИХ ЗВІРІВ І КРОЛІВ»
ДЛЯ СТУДЕНТІВ ОС «МАГІСТР»
СПЕЦІАЛЬНІСТЬ: 8.11010101 «ВЕТЕРИНАРНА МЕДИЦИНА (за видами)»
ТА «ЕПІЗООТОЛОГІЯ ТА ІНФЕКЦІЙНІ ХВОРОБИ»
ДЛЯ СТУДЕНТІВ ОС «БАКАЛАВР» 6.110101 «ВЕТЕРИНАРНА МЕДИЦИНА»
e [3201]" strokecolor="white [3212]" strokeweight="1pt"> Дніпро, 2016
Діагностична стратегія, превентивізація та програма викоренення сказуметодичні рекомендації до проведення лабораторних робіт з дисциплін «Інфекційні хвороби хутрових звірів і кролів», «Інфекційні хвороби собак і котів» для студентів ОС «Магістр» Спеціальність: 8.11010101 «Ветеринарна медицина (за видами)» та «Епізоотологія та інфекційні хвороби» для студентів ОС «Бакалавр» 6.110101 «Ветеринарна медицина» – Дніпропетровський державний аграрно-економічний університет. – Дніпро, 2016. – 18 с.
Укладачі:
д.вет.н., професор Ткаченко О.А.
к.вет.н., доцент Алексєєва Н.В.,
ст.викл. Шендрик І.М.
Рецензент: доцент кафедри нормальної і патологічної анатомії с.г. тварин
к.вет.н., Тішкіна Н.М.
Методичні рекомендації складені на основі типової програми („Епізоотологія та інфекційні хвороби”, затверджено Департаментом кадрової політики, аграрної освіти та науки 7 квітня 2004 р.) та освітньо-кваліфікаційної характеристики (ОКХ) і освітньо-професійної програми (ОПП) підготовки (ОКР „Магістр”) за спеціальністю 8.11010101 „Ветеринарна медицина (за видами)” та („Епізоотологія та інфекційні хвороби”, затверджено Департаментом аграрної освіти, науки та дорадництва Міністерства аграрної політики України 6 квітня 2010 р.) та освітньо-кваліфікаційної характеристики (ОКХ) і освітньо-професійної програми (ОПП) підготовки (ОКР „Бакалавр„) за напрямом підготовки 6.110101 «Ветеринарна медицина».
Методичні рекомендації розглянуті на засіданні кафедри епізоотології та інфекційних хвороб від « » жовтня 2016 р., протокол № .
Методичні рекомендації розглянуті та рекомендовані до печаті науково-методичною радою факультету ветеринарної медицини ДДАЕУ від « ___ » _________ 2016 р., протокол № 2.
ЗМІСТ
| ст. | ||
| ВСТУП | ||
| 1. | СУЧАСНІ МЕТОДИ ДІАГНОСТИКИ СКАЗУ | |
| 1.1. | Метод флуоресціюючих антитіл (МФА) | |
| 1.2. | Біологічна проба | |
| 1.3. | Виділення та ідентифікація вірусу в культурі клітин | |
| 1.4. | Виявлення генома вірусу | |
| 1.5. | Гістологічний метод | |
| 2. | ПРОФІЛАКТИКА ТА ЗАХОДИ БОРОТЬБИ ЗІ СКАЗОМ | |
| 3. | ЗАХОДИ ЩОДО ЛІКВІДАЦІЇ ВОГНИЩ ЗАХВОРЮВАННЯ ТВАРИН НА СКАЗ | |
| 4. | ПЕРОРАЛЬНА ІМУНІЗАЦІЯ ДИКИХ М’ЯСОЇДНИХ ПРОТИ СКАЗУ | |
| 5. | ТЕРМІНИ ТА ВИЗНАЧЕННЯ | |
| ЗАВДАННЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЮ | ||
| РЕКОМЕНДОВАНА ЛІТЕРАТУРА |
ВСТУП
Сказ – особливо небезпечна гостра вірусна хвороба всіх теплокровних тварин і людини, що характеризується ознаками поліенцефаломієліту, паралічами і закінчується загибеллю. У відповідності до оцінки ВООЗ, вона входить до п’ятірки найбільш небезпечних зоонозів.
Збудником хвороби є нейротропний РНК-геномний вірус, який відноситься до ряду Mononegavirales, родини Rhabdoviridae, роду Lyssavirus.
Після проникнення через пошкоджену шкіру чи слизову оболонку вірус сказу переміщується по нервовим закінченням у напрямку центральної нервової системи, а потім периневральним шляхом він попадає в слинні залози, виділяючись з слиною. Інкубаційний період триває від декількох днів до 1 року і більше (в середньому – 1‑2 місяці).
Збудник сказу не стійкий в зовнішньому середовищі. Він чутливий до дії ультрафіолетових і прямих сонячних променів, гине при звичайних режимах пастеризації. Прогрівання за температури 60 0С інактивує його протягом 5 хвилин, кип’ятіння – миттєво. Найбільші концентрації дезінфікуючих речовин (лугів і кислот, 2-3 % розчин хлораміну), 45-70 % етиловий спирт, мильний розчин і 5-7 % розчин йоду інактивують вірус протягом однієї хвилини. В слині вірус зберігається до однієї доби, в гниючому матеріалі – до 15 діб, в гліцерині – до 90 діб, в замороженому стані – більше двох років.
Хвороба має три послідовні стадії розвитку: продромальний період; період збудження; період паралічів.
Продромальний період (передвісники сказу) характеризується підвищеною чутливість до шуму, світла, дотику, порушенням зору, спотворенням апетиту, незначним підвищення температури тіла. Періоду збудження характерні агресивність, відсутність страху перед людиною, приступи буйства, несамовитості, судоми. Період паралічів – знижується больова чутливість, розвиваються паралічі жуйних м’язів, язика, глотки, потім задніх кінцівок і всього тіла, після чого наступає смерть.
Основним джерелом інфекції є хворі на сказ м’ясоїдні тварини. Резервуаром збудника у природі є дикі м’ясоїдні, в основному червоні лисиці.
Особливістю сказу природного типу є формування зон стійкого неблагополуччя. Такі зони розташовані, як правило, в місцевостях з підвищеною щільністю поселення лисиць. Враховуючи природне поширення сказу тварин, заходи по боротьбі з ним здійснюються комплексно органами державної ветеринарної медицини, охорони здоров'я, житлово-комунального і лісового господарства, товариствами мисливців під керівництвом надзвичайних протиепізоотичних комісій та органів державної влади на місцях.
СУЧАСНІ МЕТОДИ ДІАГНОСТИКИ СКАЗУ
Діагноз на сказ встановлюють на підставі комплексу епізоотичних, клінічних, патологоанатомічних і лабораторних досліджень.
Для проведення дослідження на сказ в лабораторію направляють свіжі трупи дрібних тварин або голови, від великих тварин – відібраний головний мозок.
Патологічний матеріал доставляють в лабораторію з супровідним документом, що містить такі дані: назва та адреса відправника, вид тварини, прізвище та адреса власника тварини, прізвище та адреса людини, яка була в контакті, інформацію про вакцинацію тварини, анамнестичні та клініко-епізоотологічні дані.
Відбирають проби головного мозку одним із методів: метод розтину черепної коробки, метод поздовжнього розпилювання голови або без розтину черепної коробки.
Найчастіше застосовують метод відбирання зразків мозку розтинанням черепної коробки з наступним відбиранням мозку.
Проби відбирають з наступних ділянок головного мозку: кори великих півкуль, мозочку, довгастого мозку та амонового рогу.
В польових умовах при відбиранні великої кількості зразків від диких тварин, рекомендовано використовувати один з методів відбирання зразків без розтину черепа: відбір через потиличний отвір або ретроорбітальним методом.
Під час транспортування матеріалу для діагностики сказу (голови тварин або зразків мозку) унеможливлюють ризик контамінації людей: мозок уміщують в вологонепроникний контейнер; голови тварин загортають в адсорбувальний матеріал, заклеюють в пластиковий пакет і опечатують, після чого поміщають в контейнер з охолоджувачем.
У разі неможливості доставити матеріал в лабораторію протягом доби, біоматеріал консервують в 30-50-відсотковому розчині гліцерину на фосфатному буфері.
Відібрані проби головного мозку зберігають за температури мінус 20 0С до завершення всіх необхідних досліджень. Після закінчення досліджень і виписування результатів весь матеріал знешкоджують автоклавуванням протягом 30 хвилин в режимі тиску 1,5 атмосфери.
Роботи з матеріалом, підозрілим в зараженні на сказ, проводять тільки в тих лабораторіях, які мають дозвіл територіальних режимних комісій на роботу із збудниками 2-4 групи патогенності. До роботи допускають тільки підготовлений персонал після отримання відповідного допуску. Весь персонал, який працює з матеріалом підозрілим в зараженні на сказ, повинен бути вакцинований не рідше 1 разу на рік за рахунок роботодавця. Особам, не щепленим проти сказу, доступ в приміщення, де проводяться роботи з матеріалом, заборонений. Люди, які працюють в лабораторіях з діагностики сказу, ризикують бути зараженими в результаті випадкового інфікування слизових оболонок під час роботи з патологічним матеріалом, або під час контакту з аерозолями, які утворюються в процесі приготування суспензії та зараженні тварин при постановці біологічної проби. Тому всі маніпуляції з матеріалом, підозрілим на зараження сказом, необхідно проводити таким чином, щоб унеможливити утворення аерозолів. Особливу увагу необхідно звернути на роботу із скельцями для мазків-відбитків.
Розтин трупа, виймання мозку та інші роботи з патологічним матеріалом проводять в умовах суворого дотримання заходів особистої безпеки: голову тварини міцно фіксують, руки захищають двома парами рукавичок – хірургічними й анатомічними, очі – окулярами, ніс і рот – 6-шаровою марлевою пов’язкою. Для цієї роботи використовують протичумний костюм 1 типу.
Лабораторні дослідження матеріалу на сказ проводять позачергово та безкоштовно. Про результати дослідження (проміжні та заключні) негайно повідомляють установу ветеринарної медицини або спеціаліста, який направив матеріал, а також головного лікаря ветеринарної медицини району (міста), які в свою чергу повідомляють відповідні державні заклади охорони здоров'я.
Діагноз на сказ вважається встановленим у разі отримання позитивних результатів хоча б одним із методів:
- ідентифікації антигену вірусу сказу методом флуоресціюючих антитіл (МФА),
- виділення вірусу біопробою на білих мишах,
- ізоляції вірусу сказу за допомогою перещеплювальної лінії культури клітин з наступною ідентифікацією МФА.
При дослідженні матеріалів від тварин, які не мали контакту з людиною (діагностичний відстріл, знайдені трупи диких та безпритульних тварин), діагноз встановлюють за результатами ідентифікації антигену вірусу сказу методом флуоресціюючих антитіл (МФА).
1.1. Метод флуоресціюючих антитіл (МФА). З усіх серологічних методів МФА отримав широке поширення. Основні його достоїнства полягають у високій чутливості (90 +99%), специфічності, простоті постановки та можливості отримання результатів протягом декількох годин. За точністю він зіставимо з біопроб, але перевершує її за рахунок виявлення антигену вірусу з низьким титром і вірулентністю в досліджуваному матеріалі. Суть методу полягає в з'єднанні мічених антитіл зі специфічним антигеном і спостереженні світних комплексів антиген-антитіло під люмінесцентним мікроскопом. Найбільш широке поширення отримав прямий метод, коли мічені ФИТЦ антирабічні антитіла наносять безпосередньо на мазки-відбитки, зрізи мозку, моношар клітин. Непридатні для дослідження проби мозку, консервовані спиртом, формаліном та іншими засобами, що викликають денатурацію і руйнування антигену вірусу.
Фіксують препарат ацетоном. При дослідженні під люмінесцентним мікроскопом антиген вірусу сказу має вигляд яскравих жовто-зелених або зелених гранул різної форми і величини, порівнянних з тільцями Бабеша-Негрі, на темному сіро-зеленому фоні.
Діагноз вважають встановленим, якщо в кількох полях зору виявляють не менше 10 типових гранул з інтенсивністю світіння не менше ніж на два хрести (++). Остаточний діагноз може бути поставлений на 4 ... 8-у добу після інфікування мишей досліджуваним матеріалом.
У тих випадках, коли на дослідження мозок поступає загнити, з нього готують матеріал і вводять по 0,05 см3 в губу білим мишам масою тіла до 8 г: від полеглих мишей беруть мозок, готують матеріал і досліджують в МФА.
1.2. Біологічна проба. Метод біологічної проби на мишах для виділення вірусу є одним з основних при постановці діагнозу. Про чутливість мишей до вірусу сказу відомо з 1935 р Високу чутливість до збудника виявляють миші у віці 2 3 сут. Суть методу полягає у виділенні вірусу від хворих, убитих або загиблих тварин шляхом введення патологічного матеріалу білим мишам і подальшої його ідентифікацією. Результат позитивної біопроби повинен бути підтверджений за допомогою МФА. Незважаючи на те що цей метод застосовують широко і він є високочутливим, він не позбавлений деяких недоліків. Крім необхідності використання більшого числа мишей потрібен тривалий час для отримання результатів: інкубаційний період при зараженні вуличним вірусом сказу коливається від 7 до 25 діб, а для деяких ізолятів до 2 міс. Це, в свою чергу, впливає на час отримання відповіді про наявність або відсутність захворювання. Однак незважаючи на ці недоліки, метод біопроби залишається самим обов'язковим і чутливим при дослідженні патматеріалу при постановці діагнозу.
1.3. Виділення та ідентифікація вірусу в культурі клітин. Виділення вірусу проводять в різних культурах клітин: нирки хом'яка (ВНК-21), мишачої нейробластоми (С-1300) клон NNA і фібросаркоми собаки (А-72). Дослідження показали високу чутливість ВНК-21, яка дозволяє протягом 24‑48 год виділити і провести титрування вуличних штамів вірусу сказу. Відомо, що клітини мишачої нейробластоми (С-1300) найбільш чутливі до зараження і не потребують адаптації вуличного вірусу в порівнянні з іншими клітинами.
Виявлення антигену вірусу сказу проводять в МФА. Виділення вірусу в культурі клітин значно скорочує час для виявлення збудника і постановки діагнозу від 21‑25 до 2 сут і виключають досліди на експериментальних тварин. Однак цей метод, на жаль, не може застосовуватися в кожній лабораторії через відсутність в них культури клітин і навичок роботи з ними. Тому внутрішньомозкове зараження мишей залишається надійним і достовірним методом лабораторної діагностики.
1.4. Виявлення генома вірусу. При діагностиці сказу використовують полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР). Вона є найбільш чутливим методом при дослідженні матеріалу з низьким титром вірусу, і це дає перевагу в діагностиці на ранній стадії хвороби. За допомогою ПЛР можна диференціювати штами вірусу сказу.
Сутність цього методу полягає у виявленні РНК вірусу; діагноз може бути поставлений протягом 5-24 год. Для ПЛР зазвичай використовують праймери, специфічно ампліфікують гени нуклеопротеіна та інші G-гени вірусу. Для дослідження беруть слину, слинну залозу, спинномозкову рідину, головний мозок.
Гістологічний метод. Заснований на виявленні в клітинах нервової тканини специфічних цитоплазматичних тілець-включень Бабеша-Негрі. Цей метод служить допоміжним, оскільки не у всіх тварин він дозволяє виявити тільця. За оцінкою різних дослідників, тільця Бабеша-Негрі не вдається виявити в 10 50% випадків захворювання по ряду об'єктивних причин: тривалість перебігу хвороби, властивості збудника, своєчасне взяття матеріалу для дослідження, правильність його зберігання та доставка в лабораторію.
| Рис. 1. Тільця Бабеша-Негрі у гістологічному зрізі |
З патологічного матеріалу (Амонового роги, кора великих півкуль, мозочок, довгастий мозок) готують мазки-відбитки. При виготовленні мазків не слід брати занадто великі шматочки мозкової тканини, так як при натисненні і розмазування виходять товсті шари. Для фарбування мазків використовують різні методи: по Селлерсу, Морозову, Манну та ін. Пофарбовані препарати переглядають під світловим мікроскопом.
Позитивним результатом вважають, коли виявляють чітко окреслені овальні або довгасті гранулярні освіти діаметром 2‑10 мкм (тільця Бабеша-Негрі) рожево-червоного або іншого, залежно від барвника, кольору, розташовані в нейронах. При перегляді нерідко знаходять сформовані бичка поза клітин; їх також треба враховувати при постановці діагнозу. Для диференціювання тілець Бабеша-Негрі від інших внутрішньоклітинних включень, що зустрічаються при чумі м'ясоїдних і інфекційному гепатиті, застосовують звичайну забарвлення препаратів гематоксилін-еозином.