Визначення пероксидазної активності метміоглобіну

Пероксидазна активність. Вперше вона виявлена у Mb Кейлін і Хартрі. Ними було показано, що при взаємодії з пероксидами мет-Mb окислюється до ферил-Mb. Аналогічні переходи були встановлені Каплан-Бреслер. Виявлено, що при додаванні мет-Mb до препаратів мітохондрій в присутності субстратів і кофакторів спостерігається швидке окислення мет-Mb. Окислення інгібується каталозою.

Встановлений тісний взаємозв'язок між пероксидазними властивостями міоглобіну і роботою фосфорилюючого дихального ланцюга. Активація окислювально-відновних перетворень фосфорилюючого дихального ланцюга шляхом додавання до суспензії мітохондрій АДФ з фосфатом, Са²⁺ чи дикумарола призводить до швидкого окислення метміоглобіну до чотирьохвалентного ферил-Mb. Про взаємозв'язок пероксидазної реакції з роботою дихального ланцюга свідчить також кореляція між ступінню вираженості окисно-відновного переходу мет-Mb і величиною дихального контролю. Показано, що перехід Mb в ферил-форму найбільш інтенсивно відбувається у свіжовиділених мітохондріях з високим дихальним контролем. Ця реакція менш виражена в мітохондріях з низьким дихальним контролем.

Показано, що в мітохондріях при додаванні до них мет-Mb в концентрації 2х10^-6 М спостерігається значно більш інтенсивне окислення НАД .Н, ніж в експериментах без Mb. Встановлений факт можна пояснити оборотом реакції окислення метміоглобіна НАД .Н.

Враховуючи метаболічну важливість пероксидів в організмі, не можна виключити можливу роль системи мет-Mb – ферил-Mb в модулюванні високої резистентності і збереженні функціональної активності міоцитів в умовах гіпоксії чи відносного анаеробіозу при м'язовій роботі. Частка функціонального міоглобіну в оксі-формі під дією метаболітної перекисі водню може окислюватись за схемою :

2[Fe^II]²⁺ + H₂O₂ +2H⁺ ®[2Fe^III]³⁺ + H₂O

[Fe^III]³⁺ + H₂O₂ ® [Fe^VO]³⁺ + H₂O

при цьому досягається знешкодження токсичних для дихального ланцюга пероксидів. Ферильна форма, як окислювач, може акцептувати електрони дихального ланцюга. Акцептуючи електрони, ферил-Mb відновлюється до вихідного стану і може знову вступати в реакцію знешкодження пероксидів, якщо по яким-небудь причинам концентрація їх перевищує фізіологічний рівень.

Не виключено, що Mb може приймати пряму участь в мітохондріальному диханні і виконувати роль акцептора електронів. Напевне, ця специфічна функція повинна зростати зі збільшенням концентрації Mb у м'язових клітинах, коли можливо утворення прямого контакту гемопротеїду з мітохондріями.

Отже, може виконувати дві спарені функції: участь в пероксидазній реакції, зв'язаній з продукуванням енергії в дихальному ланцюгу, і участь у знешкодженні пероксидів. Значення пероксидних реакцій у зв'язку з цим важко переоцінити. Їх роль збільшується в глибині міцних м'язів, які скорочуються на порівняно довгий період, коли доступ кисню до міоцитів внаслідок стиснення капілярів обменено, при різних патологічних процесах, а також у випадку припинення зовнішнього дихання на тривалий період, наприклад, у пірнаючих тварин при зануренні у воду.

Виявлено, що пероксидазна активність мет-Mb пірнаючих тварин корелює з продовженням їх занурення в воду і у наземних тварин – з силою м'язового скорочення.

У літературі описано, що при взаємодії мет-Mb з пероксидами він окислюється до ферил-Mb (чотирьохвалентна форма). Окиснення інгібується каталазою. Показаний тісний взаємозвязок між пероксидазними властивостями міоглобіну і фосфорилюванням у дихальному ланцюзі. Доля функціонального міоглобіну в окси-формі за дії метаболічного гідроген пероксиду може легко окислюватися, що призведе до знежкодження токсичних для дихального ланцюга пероксидів. Ферильна форма, як окислювач, може виступати акцептором електронів дихального ланцюга. Акцептуючи електрони, ферил-Mb відновлюється до вихідного стану і може знову вступати у реакцію як донор електронів.

Хід роботи.

Обладнання: 1. Колонка розміром 1.2´30 см, упаковану сефадексом G-25 (середній);

2. Спектрофотометр СФ-46, або ФЕК- .

3. Штатив з пробірками.

Реактиви: 1. Метміоглобін (MetMb) – очищений попередньо за допомогою гель-фільтрації через колонку з сефадексом, як описано у п. 3.5.2..

2. K₃Fe(CN)₆ .

3. Гваякол – 0,6 мл розплаву розчиняють в 100 мл води і доводять об’єм до 200 мл (це відповідає концентрації гваякола 27мМ).

4. Гідроген пероксид.

5. 0,1 н ацетатний буфер, рН 5,33.

Підготовка реактивів.

1. Приготування розчину Н₂О_2. Вихідний розчин Н₂О₂ розводять до концентрації 0,05 Н (25 мМ). Для цього беруть 0,5 мл свіжого гідроген пероксиду розводять дистильованою водою до 150 мл і визначають на спектрофотометрі поглинання при 440 нм, або при 470 нм. Враховуючи коефіцієнт мілімолярної екстинкції при відповідній довжині хвилі визначають нормальність одержаного розчину.

Коефіцієнт мілімолярної екстинції:

Н₂О₂ = 22,2 мМ^-1´см^-1 (440 нм)

Н₂О₂ = 26,6 мМ^-1´см^-1 (470 нм)

При довжині хвилі 240 нм коефіцієнт мілімолярної екстинції Н₂О₂ = 43,6 мМ^-1´см^-1.

2. Для приготування ацетатного буферу змішують 86 мл заздалегідь приготовленого 0,2 М оцтовокислого натрію і 14 мл 0,2 М оцтової кислоти, доводять об’єм водою до 200 мл.

Підготовка міоглобіну. До очищеного від сірчанокислого амонію розчину міоглобіну додається в надлишку кристалічний (K₃Fe(CN)_6.) для повного переведення його у метформу. Розчин піддається гель-фільтрації на колонці з сефадексом G-25 для очистки від надлишку (K₃Fe(CN)₆).

Використовуючи спектрофотометричний метод і коефіцієнт мілімолярної екстинції (мМ), визначають концентрацію метміоглобіна, що піддавався гель-фільтрації. Розводять бідистильованою водою до концентрації 20-25 мкг/мл.

Хід визначення:

1. Реакційну суміш для визначення пероксидазної активності метміоглобіну готують за схемою:

Vмл MetMb + (2-V) мл Н₂О + 2 мл буфера + 0,5 мл гваяколу

(0,5 MetMb + 0,5 мл Н₂О + 1 мл буфера + 0,25 мл гваяколу)

2. Суміш переносять в спектрофотометричну кювету.

3. Як контроль використовують таку ж суміш. Однак, замість гідроген пероксиду вносять ту ж кількість води.

4. В дослідну пробу вносять 0,5 (0,25) мл гідроген пероксиду, швидко перемішують, закривають кювету і проводять спектрофотометрування зразка. Початок реакції відраховують з часу введення Н₂О₂. Спостерігається утворення забарвленого комплексу, кількість якого зростає, повязаної з розщепленням Н₂О₂ , вивільненням .

5. За ходом реакції спострерігають по зміні поглинання світла при 440 нм за допомогою спектрофотометра СФ-46 або ФЕК. поглинання фіксують

Величину Т (пропускання), або Д (поглинання) проводять через кожні 30 с.

Краще перевести значення Т в значення Д (поглинання): Д = 2 – lg Т.

6. Пероксидазну активність визначають за формулою:

А = ΔD· V · 1000/ε · a· c,

де : А – пероксидазна активність MetHb;

ΔD – середнє значення вимірювання оптичної густини проби при довжині хвилі 440 нм;

V - загальний об’єм суміші у кюветі;

1000 – коефіцієнт перерахунку від мікромоля до наномоля;

ε - коефіцієнт мілімолярної екстинкції ( 6,22 мкм^-1·см^-1);

a – об’єм зразка у кюветі;

c – концентрація міоглобіну (зразка).

7. Будують кінетичну криву, як функцію Д = f(t) і знаходять початкову швидкість пероксидазної реакції по тангенсу кута прямолінійної кривої в одиницях оптичної густини (швидкість реакції виражають в мкМ/с, використовуючи множинник 11,23, одержаний калібровкою за допомогою окисної системи Ag⁺ -S₂O₈^2--.

Графік стр. 82.Міоглобіни

Рис.3.5.3.1. Кінетичні криві пероксидазної активності мет-Мb