Конъюгация ферментов и иммобилизация антител и антигенов на твердую фазу

Высокая чувствительность методов ИФА основана на использовании ферментной метки конъюгированной с антителами. Методы получения конъюгатов в зависимости от типа сшивающего реагента можно разделить на две группы:

- гомобифункциональные

- гетеробифункциональные

При получении конъюгатов с помощью гомобифункциональных реагентов часто используют глутаровый альдегид. Этот сшивающий реагент взаимодействует с аминогруппами лизиновых остатков антител и ферментов (рис. 6).

Рисунок 6. Гомобифункциональный метод получения конъюгатов.

Процесс конъюгации может проходить в одну или в две стадии. Этот метод применяют для получения конъюгатов антител с пероксидазой хрена и алкалиновой фосфотазы. Достоинство этого метода – его простота, однако выход готового продукта небольшой.

В гетеробифункциональном методе получения конъюгатов в качестве сшивающего реагента используют различные соединения, основным компонентом которых является малеимид. Метод заключается во введении малеимидных групп в молекулу белка (фермента или антитела) при взаимодействии группы сшивающего реагента с NH₂ группой фермента с образованием пептидной связи, которые затем реагируют с SH-группой другого белка (антитела или фермента).

Рисунок 7. Гетеробифункциональный метод получения конъюгатов.

При отсутствии свободных SH-групп в молекуле белка они могут быть введены в состав молекулы несколькими методами (рис. 7). Гетеробифункциональный метод имеет высокий выход конъюгата.

Кроме вышеперечисленных методов широкое распространение для получения конъюгатов с пероксидахзой хрена имеет перйодатный метод (метод Накане (1974)). Его сущность состоит в модификации фермента с образованием активных альдегидных групп, которые затем реагируют с NH₂ группами антител (рис. 8).

Рисунок 8. Перйодатный метод получения конъюгатов.

Одной из важных стадий многих методов ИФА (твердофазные методы ИФА) является иммобилизация антител или антигенов на нерастворимые носители (твердая фаза). Иммобилизованные на твердой фазе вещества называют иммуносорбенты. В настоящее время в качестве твердой фазы используют пробирки и планшеты из непористых полимерных материалов – полистирола, поливинилхлорида и т.д. Иммобилизация может осуществляться либо за счет ковалентного связывания, либо за счет адсорбции вещества на поверхность носителя. Адсорбционная иммобилизация в настоящее время является основным способом, так как благодаря своей простоте этот способ позволяет автоматизировать проведение анализа. Однако возможная элюция части адсорбированного материала в процессе инкубации и отмывок является недостатком этого метода. Процесс адсорбции на поверхность носителя осуществляется за счет ионных и гидрофобных взаимодействий, а также благодаря водородным связям. Количество сорбированного вещества будет определяться площадью поверхности, временем контакта, концентрацией белка, рН, температурой и рядом других факторов.

Ковалентное связывание белка с твердой фазой предусматривает предварительную обработку поверхности пробирок или планшет каким либо активатором. В качестве активирующих веществ используют водный раствор глутарового альдегида, толуол-2,4-диизоцианат и поли-L-лизин. Механизм активации как правило связан с прочной адсорбцией активатора (для поли-L-лизин адсорбция необратимая) и его последующим ковалентным связыванием с белковой молекулой.