Выделение чистой культуры анаэробов схематично

Культивирование анаэробных организмов в основном является задачей микробиологии.

Сложнее дело обстоит с культивированием анаэробных многоклеточных организмов, поскольку для их культивирования часто необходима специфическая микрофлора, а также определённые концентрации метаболитов. Применяется, например, при исследовании паразитов человеческого организма.

Для культивирования анаэробов применяют особые методы, сущность которых заключается в удалении воздуха или замены его специализированной газовой смесью (или инертными газами) в герметизированных термостатах — анаэростатах[7].

Другим способом выращивания анаэробов(чаще всего микроорганизмов) на питательных средах — добавление содержащих редуцирующие вещества(глюкозу, муравьинокислый натрий и др.), уменьшающие окислительно-восстановительный потенциал.

Общие питательные среды для анаэробных организмов

Для общей среды Вильсона — Блера базой является агар с добавлением глюкозы, сульфита натрия и двуххлористого железа. Клостридии образуют на этой среде колонии чёрного цвета за счет восстановления сульфита до сульфид — аниона, который соединяясь с катионами железа (II) дает соль чёрного цвета. Как правило, черные на этой среде образования колонии, появляются в глубине агарового столбика.[8]

Среда Китт — Тароцци состоит из питательного бульона, 0,5 % глюкозы и кусочков печени или мясного фарша для поглощения кислорода из среды. Перед посевом среду прогревают на кипящей водяной бане в течение 20 — 30 минут для удаления воздуха из среды. После посева питательную среду сразу заливают слоем парафина или вазелинового масла для изоляции от доступа кислорода.

[править] Общие методы культивирования для анаэробных организмов

GasPak — система химическим путем обеспечивает постоянство газовой смеси приемлемой для роста большинства анаэробных микроорганизмов. В герметичном контейнере, в результате реакции воды с таблетками боргидрида натрия и бикарбоната натрия образуется водород и диоксид углерода. Водород затем реагирует с кислородом газовой смеси на палладиевом катализаторе с образованием воды, уже вторично вступающей в реакцию гидролиза боргидрида.

Данный метод был предложен Брюером и Олгаером в 1965 году. Разработчики представили одноразовый пакет, генерирующий водород, который был позднее усовершенствован ими до саше, генерирующих двуокись углерода и содержащих внутренний катализатор[9][10].

Метод Цейсслера применяется для выделения чистых культур спорообразующих анаэробов. Для этого производят посев на среду Китт-Тароцци, прогревают 20 мин при 80 °C (для уничтожения вегетативной формы), заливают среду вазелиновым маслом и инкубируют 24 ч в термостате. Затем производят посев на сахарно-кровяной агар для получения чистых культур. После 24-часового культивирования интересующие колонии изучаются — их пересеивают на среду Китт-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры).

Метод Фортнера— посевы производят на чашку Петри с утолщенным слоем среды, разделённым пополам узкой канавкой, вырезанной в агаре. Одну половину засевают культуру аэробных бактерий, на другую — анаэробных. Края чашки заливают парафином и инкубируют в термостате. Первоначально наблюдают рост аэробной микрофлоры, а затем (после поглощения кислорода) — рост аэробной резко прекращается и начинается рост анаэробной.

Метод Вейнберга используется для получения чистых культур облигатных анаэробов. Культуры, выращенные на среде Китта-Тароцци, переносят в сахарный бульон. Затем одноразовой пастеровской пипеткой материал переносят в узкие пробирки (трубки Виньяля) с сахарным мясо-пептонным агаром, погружая пипетку до дна пробирки. Засеянные пробирки быстро охлаждают, что позволяет фиксировать бактериальный материал в толще затвердевшего агара. Пробирки инкубируют в термостате, а затем изучают выросшие колонии. При обнаружении интересующей колонии на её месте делают распил, материал быстро отбирают и засеивают на среду Китта-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры).

Метод Перетца

Метод Перетца —в расплавленный и охлаждённый сахарный агар вносят культуру бактерий и заливают под стекло, помещённое на пробковых палочках(или фрагментах спичек) в чашку Петри. Метод наименее надежен из всех, но достаточно прост в применении.

Дифференциально — диагностические питательные среды

Среды Гисса: К 1 % пептонной воде добавляют 0,5 % раствор определенного углевода (глюкоза, лактоза, мальтоза, маннит и др.) и кислотно-щелочной индикатор Андреде, разливают по пробиркам, в которые помещают поплавок для улавливания газообразных продуктов, образующихся при разложении углеводородов.

Среда Ресселя применяется для изучения биохимических свойств энтеробактерий(шигелл, сальмонелл). Содержит питательный агар, лактозу, глюкозу и индикатор (бромтимоловый синий). Цвет среды травянисто-зелёный. Обычно готовят в пробирках по 5 мл со скошенной поверхностью. Посев осуществляют уколом в глубину столбика и штрихом по скошенной поверхности.

Среда Плоскирева (бактоагар Ж) — дифференциально-селективная среда, поскольку подавляет рост многих микроорганизмов, и способствует росту патогенных бактерий (возбудителей брюшного тифа, паратифов, дизентерии). Лактозоотрицательные бактерии образуют на этой среде бесцветные колонии, а лактозоположительные — красные. В составе среды — агар, лактоза, бриллиантовый зелёный, соли желчных кислот, минеральные соли, индикатор (нейтральный красный).

Висмут-сульфитный агар предназначен для выделения сальмонелл в чистом виде из инфицированного материала. Содержит триптический гидролизат, глюкозу, факторы роста сальмонелл, бриллиантовый зелёный и агар. Дифференциальные свойства среды основаны на способности сальмонелл продуцировать сероводород, на их устойчивости к присутствию сульфида, бриллиантового зелёного и лимоннокислого висмута. Маркируются колонии в чёрный цвет сернистого висмута (методика схожа со средой Вильсона — Блера).

Метаболизм анаэробных организмов имеет несколько различных подгрупп:

Организмы способные использовать анаэробное дыхание (другие окислители — серу, азот (см.Анаэробное дыхание), хлораты, перхлораты, хроматы и перманганаты[11])

Использующие циклическое фотосинтетическое фосфорилирование (лучевую энергию (чаще всего Солнца)) — фототрофные анаэробы (см. также Аноксигенный фотосинтез)

Организмы, энергетический обмен которых опирается на катаболизм высокомолекулярных/высокоэнергетических соединений (например, гликолиз).

Анаэробный энергетический обмен в тканях человека и животных[12]

Анаэробное и аэробное энергообразование в тканях человека

Некоторые ткани животных и человека отличаются повышенной устойчивостью к гипоксии (особенно мышечная ткань). В обычных условиях синтез АТФ идет аэробным путем, а при напряженной мышечной деятельности, когда доставка кислорода к мышцам затруднена, в состоянии гипоксии, а также при воспалительных реакциях в тканях доминируют анаэробные механизмы регенерации АТФ. В скелетных мышцах выявлены 3 вида анаэробных и только один аэробный путь регенерации АТФ.

3 вида анаэробного пути синтеза АТФ

К анаэробным относятся:

Креатинфосфатазный (фосфогеный или алактатный) механизм — перефосфорилирование между креатинфосфатом и АДФ

Миокиназный — синтез (иначе ресинтез) АТФ при реакции трансфосфорилирования 2 молекул АДФ(аденилатциклаза)

Гликолитический — анаэробное расщепление глюкозы крови или запаса гликогена, заканчивающийся образованием молочной кислоты (иначе именуется «лактатным»).

Необходимо отметить, что прямым следствием гликолиза является критическое снижение рН тканей — ацидоз. Это ведет к снижению эффективного транспорта кислорода гемоглобином, и формирует положительную обратная связь.

Каждый механизм имеет свое время удержания максимальной мощности и оптимум энергообеспечения тканей. Наибольшая мощность и наименьшее время удержания:

креатинфосфаткиназный механизм (3600 (Дж·кг)/мин, при времени 6—12 сек)

лактатный (2510 (Дж·кг)/мин, при времени 30—60 сек)

аэробный (600 (Дж·кг)/мин, при времени около 600 секунд).

[править] Примечания

↑ Газогенерирующие контейнерные системы GasPak: Инструкция МК. — OOO "МК, официальный дистрибьютер Becton Dickinson International", 2010. — С. 7.

↑ 1 2 3 К.Д.Пяткин Микробиология с вирусологией и иммунологией. — М:"Медицина", 1971. — С. 56.

↑ Л.Б.Борисов Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. — МИА, 2005. — С. 154-156. — ISBN 5-89481-278-X

↑ Д.Г.Кнорре Биологическая химия:Учеб. для хим., биол. и мед.спец.вузов. — 3. — М.:Высшая школа, 2000. — С. 134. — ISBN 5-06-003720-7

↑ D.A.Eschenbach, P.R.Davick, B.L.Williams Prevalence of hydrogen peroxide-producing Lactobacillus species in normal women and women with bacterial vaginosis.. — J Clin Microbiol. 1989 February; 27(2): 251–256..

↑ М.В.Гусев,Л.А.Минеева Микробиология. — М:МГУ, 1992. — С. 56.

↑ А.А. Воробьев Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. — МИА, 2003. — С. 44. — ISBN 5-89481-136-8

↑ Л.Б.Борисов Руководство к лабораторным занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. — Медицина, 1992. — С. 31-44. — ISBN 5-2225-00897-6

↑ J.H.Brewer, D.L.Allgeier Disposable hydrogen generator.. — Science 147:1033-1034.. — 1966.

↑ J.H.Brewer, D.L.Allgeier Safe self-contained carbon dioxide-hydrogen anaerobic system.. — Appl. Microbiol.16:848-850.. — 1966.

↑ G.F.Smirnova Metabolism peculiarities of bacteria restoring chlorates and perchlorates.. — Microbiol Z. 2010 Jul-Aug;72(4):22-8..

↑ Филиппович Ю.Б., Коничев А.С., Севастьянова Г.А. Биохимические основы жизнедеятельности организма человека. — Владос, 2005. — С. 302. — ISBN 5-691-00505-7

[править] См. также

Аэробы

[править] Ссылки

Анаэробии (анаэробы) // Энциклопедический словарь Брокгауза и Ефрона: В 86 томах (82 т. и 4 доп.). — СПб.: 1890—1907.

Анаэробы // Энциклопедический словарь Брокгауза и Ефрона: В 86 томах (82 т. и 4 доп.). — СПб.: 1890—1907.

ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ

Питание бактерий. Питательные вещества – источники углерода и азота. Классификация бактерий по типам питания Аутотрофы и хемоорганотрофы

Катаболи́зм (от греч. καταβολή, «основание, основа») — процесс метаболического распада, разложения на более простые вещества или окисления какого-либо вещества, обычно протекающий с высвобождением энергии в виде тепла и в виде АТФ. Катаболические реакции лежат в основе диссимиляции: утраты сложными веществами своей специфичности для данного организма в результате распада до более простых.

Анаболи́зм (от греч. ἀναβολή, «подъём») — совокупность химических процессов, составляющих одну из сторон обмена веществ в организме, направленных на образование составных частей клеток и тканей. Анаболизм взаимосвязан с противоположным процессом — катаболизмом, так как продукты распада различных соединений могут вновь использоваться при анаболизме, образуя в иных сочетаниях новые вещества. Процессы анаболизма, происходящие в зелёных растениях с поглощением энергии солнечных лучей (см. Фотосинтез), имеют планетарное значение, играя решающую роль в синтезе органических веществ из неорганических.

Анаболизм (пластический обмен, ассимиляция) — одна из сторон обмена веществ. Включает процессы

По типу питания все организмы делятся на автотрофов и гетеротрофов. Автотрофы, что в переводе с греческого означает «самопитающиеся», могут строить все соединения своих клеток из углекислоты и других неорганических веществ. Источником энергии для них служит либо свет (фотоавтотрофы), либо они ее получают при окислении минеральных соединений (хемоавтотрофы). Таким образом, ни для конструктивных, ни для энергетических процессов органические субстраты автотрофам не требуются.

Гетеротрофы также могут усваивать углекислоту. Однако им необходимы органические соединения как основные источники углерода, а в большинстве случаев и субстраты для получения энергии (хемоорганогетеротрофы). Такой тип питания реализуется у человека, животных и многих микроорганизмов. Лишь для некоторых бактерий, нуждающихся в готовых органических соединениях, источником энергии является свет (фотогетеротрофы).

Среди автотрофов наиболее широко распространены организмы, использующие лучистую энергию. Они представлены высшими растениями, водорослями и рядом бактерий, способных к фотосинтезу.

Хемоавтотрофы обнаружены только среди бактерий, т. е. только среди прокариотных организмов, причем количество их сравнительно невелико. Однако по своим физиолого-биохимическим свойствам, геохимической деятельности и значению для некоторых областей народного хозяйства эти микроорганизмы весьма интересны.

Существование хемоавтотрофов было открыто С. Н. Виноградским. Началом послужили его работы (1885—1889) по изучению нитчатых микроорганизмов, называемых серобактериями (Beggiatoa) и железобактериями (Leptothrix ochracea). В результате проведенных наблюдений Виноградский пришел к выводу, что жизнедеятельность указанных форм связана с окислением соответственно сероводорода и серы до серной кислоты или закисного железа в окисное и оба процесса имеют энергетическое значение.

Свою гипотезу Виноградский блестяще доказал, выделив (1890—1892) чистые культуры нитрифицирующих бактерий (Nitrosomonas и Nitrobacter), которые росли на минеральных средах, окисляя аммонийный азот или нитриты и фиксируя при этом углекислоту.

В настоящее время хемоавтотрофов подразделяют на следующие группы, получившие свои названия соответственно природе окисляемых субстратов:

1. Нитрифицирующие бактерии.

2. Водородные бактерии.

3. Серобактерии и тионовые бактерии.

4. Железобактерии.

Кроме того, к хемоавтотрофам, видимо, принадлежит недавно обнаруженный Н. Н. Ляликовой-Медведевой микроорганизм Stibiobacter, окисляющий окислы трехвалентной сурьмы (Sb2О3) до пятивалентной (Sb205).

Таким образом, выявлены хемоавтотрофы, способные получать энергию в результате окисления минеральных соединений пяти элементов: Н, N, S, Fe и Sb.

Факторы роста и их источники. Источники минеральных элементов.

Способы и механизмы переноса питательных веществ через мембрану.

Энергетические потребности бактерий. Пути получения энергии у аутотрофов (фотосинтез, хемосинтез). Источники и пути получения энергии у хемоорганотрофов.

Аэробный и анаэробный типы биологического окисления у бактерий. Аэробные, анаэробные, факультативно анаэробные и микроаэрофильные бактерии. Способы создания анаэробных условий.

Задачи, этапы, преимущества и недостатки бактериологического (культурального) метода исследования.

Рост и размножение микроорганизмов. Способы размножения. Бинарное (простое) деление, механизм. Размножение бактериальных популяций.

Принципы и методы культивирования бактерий. Питательные потребности микробов.

Питательные среды для культивирования бактерий. Требования к питательным средам. Классификация питательных сред.

Условия и техника культивирования бактерий. Техника посева на питательные среды. Закономерности и характер роста бактерий на плотных и жидких питательных средах.

Способы выделения чистых культур аэробных и анаэробных бактерий.

Свойства, используемые для идентификации выделенных культур.