Лабораторно- практическое занятие № 1

Методические указания для выполнения лабораторных работ по микробиологии

Лабораторно- практическое занятие № 9

Тема: Микрофлора воздуха. Учет численности КОЕ в воздухе

Цель работы:Ознакомить студентов с методом оседания микробов по Коху.

Клетки микроорганизмов, попав в питательную среду, начинают размножаться и образуют видимые невооруженным глазом колонии. Каждая колония на чашке с питательной сре­дой вырастает из одной колониеобразующей единицы (КОЕ), ко­торая может представлять собой бактериальную, дрожжевую клетку, спору, кусочек мицелия актиномицета или гриба. Че­рез 48 ч инкубации чашки вынимают из термостата и предва­рительно подсчитывают число колоний. В связи с тем, что су­ществуют медленнорастущие формы бактерий, окончательный подсчет делают на 5-е сут.

Иногда клеток так много, что развившиеся колонии микроорганизмов сливаются, что часто наблюдается в чашках при разведении 10^-2. При высоких разведениях вырастают единичные колонии (меньше 10 на чашке), которые могут образоваться от случайно попавших клеток из воздуха при внесении в чашку почвенной суспензии или питательной среды. Учет та­ких чашек сделает подсчет недостоверным. Для правильного определения численности КОЕ подсчитывают только чашки, в которых колоний свыше 10 и не более 250—300 (в последнем случае при условии, если колонии очень мелкие).

При подсчете колоний чашки просматривают в проходящем свете и, чтобы дважды не учитывать одни и те же колонии, подсчитанные отмечают чернилами или тушью. Чтобы не пропустить мелкоточечные колонии, чашки дополнительно просматривают под лупой. Бывают случаи, когда в последнем разведении (10^-6) число колоний значительно больше 300. Такой посев желательно повторить, увеличив число разведений. Если это невозможно, подсчет выполняют, учитывая, что он дает представление лишь о минимальной численности микроорганизмов в почве.

Для определения количества КОЕ в воздухе можно ис­пользовать и более простой, но менее точный метод Коха (осаждение клеток микроорганизмов на плотных питательных средах). Суть его сводится к следующему. Стерильные чашки Петри с питательной средой (МПА, МПЖ или кусок вареной картофелины) открывают в исследуемом помещении (или на исследуемой площади) на 5 мин. Частицы пыли с бактериями под действием силы тяжести оседают на поверхность плотной питательной среды. Через 48 ч инкубации при 28—30°С осев­шие бактерии образуют на среде колонии, которые можно подсчитать (см. 5.1.1). Поскольку некоторые микроорганизмы развиваются медленно, окончательно подсчитывают колонии на 5-е сут.

На площади в 100 см² за 5 мин осаждается примерно столько клеток, сколько их находится в 10 л воздуха (0,01 м³). Зная площадь чашки Петри, можно подсчитать количество клеток в 1 м³ воздуха. Для этого число колоний, выросших в чашке Петри, относят к общей площади чашки, затем пере­считывают, сколько таких колоний поместилось бы на 100 см² и далее - в 1 м³ воздуха.

Пример расчета. В чашке Петри диаметром 10 см выросло 45 колоний. Площадь чашки (πr²) составит 3,14 * 5² = 78,5 (см²).

Далее подсчитывают число клеток на 100 см² (равнозначных 10 л, или 0,01 м³ воздуха):

78,5 см² воздуха содержат 45 клеток

100,0 см² » » х

Х= 100*45 =57(клеток)

78,5

Таким образом, в 0,01 м³ воздуха находится 57 клеток, а в 1 м³ их будет в 100 раз больше — 5700.

Контрольные вопросы:

1. Что такое микрофлора воздуха?

2. Каким образом исследуют микрофлора воздуха?

3. Что такое колониеобразующая единица (КОЕ)?

4. Определение КОЕ воздуха методом Коха.

Материалы и оборудование

Зерно в колбах, пробы соломы, весы, предметные стекла, колбы со стерильной водой (по 90 мл), колбы со стерильной водой (по 50 мл) и песком, стерильные пипетки на 10 и 1 мл, стерильные чашки Петри, МПАв пробирках и колбах, водяная баня, треножник, микроскопы и все необходимое для микроскопирования.

Контрольные вопросы:

1. Что такое эпифитная микрофлора зерна?

2. Основной представитель эпифитной микрофлоры зерна.

3. Роль эпифитной микрофлоры в сохранении зерна.

Методические указания для выполнения лабораторных работ по микробиологии

Лабораторно- практическое занятие № 1

Тема:Микробиологическая микробиология. Микроскопы. Устройство микроскопа.

Цель занятия: Ознакомиться с техникой безопасности при работе в микробиологической лаборатории. Правила работы с микроскопом. Изучить разновидности световой микроскопии: темнопольная, фазово - контрастная, люминесцентная.

Правила по технике безопасности при работе в микробиологической лаборатории.

1. Не входить в лабораторию в пальто, головном уборе, не вносить посторонние вещи.

2. Приступать к занятиям, надев хлопчатобумаж­ный халат.

3. Строго соблюдать правила обращения с химическими реактивами и красителями.

4. С большой осторожностью пользоваться смесью спирта с эфиром, не переносить ее на столы с горелками.

5. Поскольку некоторые микроорганизмы, особенно споры грибов, являются аллергенами, не допускать их распыления — не оставлять открытыми чашки Петри, пробирки, колбы с культурами микроорганизмов.

6. Перед тем как набирать ртом с помощью пипетки сус­пензии микроорганизмов или реактивы, убедиться в том, что пипетка закрыта с тупого конца ватой.

7. В лаборатории поддерживать порядок и чистоту. По окончании занятий протирать иммерсионный объектив микро­скопа мягкой тканью, накрывать микроскоп полиэтиленовым чехлом, приводить в порядок рабочее место, мыть руки.

8. Помнить о том, что студенты несут ответственность за используемые ими микроскопы, другое лабораторное оборудо­вание, чистоту рабочего места.

9. Перед уходом из лаборатории дежурному проверять, выключены ли газ, вода, электроприборы.

Микроорганизмы можно обнаружить только при помощи оп­тического или электронного микроскопа. Максимальное увеличе­ние оптического микроскопа составляет 3000. Это позволяет разли­чать частицы размером не менее 0,1—0,2 мкм¹. Современные электронные микроскопы имеют разрешающую способность до 0,15 нм², что дает возможность видеть не только мельчайшие орга­низмы, но и тонкие структуры клеток. Подобный микроскоп увели­чивает рассматриваемый объект в 750 000 раз.

Микроскопия в темном поле.В основе метода лежит эффект Тиндаля — рассеивающийся пучок света при наблюдении сбоку имеет вид голубоватого конуса на темном фоне. Другими словами, при освещении объекта косыми лучами света эти лучи, не попадая в объек­тив, остаются невидимыми для глаза, поэтому поле зрения выглядит темным. В то же время оптически неоднородные клетки, находящиеся в поле зрения и попадающие в сферу прохождения лучей, отклоняют их в такой степени, что лучи попадают в объектив. Поскольку лучи света идут именно от объектов, наблюдатель видит их в темном поле интенсивно светящимися. Метод используется при исследовании живых клеток микроорганизмов.

Микроскопия с фазово-контрастным устройством.Глаз человека различает световые волны по длине (цвет) и амплитуде (интенсивность, контрастность), но не различает их по фазе.

Метод фазово-контрастной микроскопии разработан для наблюдения за прозрачными объектами. Он основан на преоб­разовании фазовых изменений, претерпеваемых световой волной при прохождении через объект, в видимые амплитудные с помощью определенного оптического устройства.

Для проведения исследований необходимо в дополнение к световому микроскопу иметь фазово-контрастное устройство (наиболее широко распространена модель КФ-4), которое со­стоит из фазовых объективов (на оправе имеется буква «Ф»), конденсоров с набором кольцевых диафрагм и вспомогательного микроскопа (оптического устройства, помещаемого в тубус вместо окуляра при установке фазового контраста). Метод применяют для исследования живых клеток мик­роорганизмов, контрастность которых достигается оптическим путем без вмешательства в их физиологические процессы.

Люминесцентная, или флуоресцентная, микроскопия.Некоторые биологические объекты способны при освещении коротковолновыми лучами (сине-фиолетовыми, ультрафиоле­товыми) поглощать их и испускать лучи с более длинной вол­ной. При этом клетки будут светиться желто-зеленым или оранжевым светом. Это собственная, или первичная, люминес­ценция.

Нелюминесцирующие объекты можно обработать специ­альными флуоресцирующими красителями — флуорохромами (акридином желтым, акридином оранжевым, аурамином, примулином, тиофлавином, конго красным) и также наблюдать люминесценцию. Это будет наведенная, или вторичная, люми­несценция. Препараты, окрашенные флуорохромами, изучают в сре­дах, не люминесцирующих под действием коротковолновых лучей: в воде, глицерине, вазелиновом масле или физиологиче­ском растворе.

Люминесцентная микроскопия по сравнению с обычной позволяет:

- сочетать цветное изображение и контрастность объектов;

- изучать морфологию живых и мертвых клеток микроор­ганизмов в питательных средах и тканях животных и растений;

- исследовать клеточные микроструктуры, избирательно поглощающие различные флуорохромы, являющиеся при этом специфическими цитохимическими индикаторами;

- определять функционально-морфологические измене­ния клеток;

- использовать флуорохромы при иммунологических реак­циях и подсчете бактерий в образцах с невысоким их содержа­нием.

Электронная микроскопия.По схеме строения электронный микроскоп аналогичен свето­вому, но освещение объекта обеспечивает не луч света, а поток электронов от вольфрамовой нити, нагреваемой электриче­ским током. Разрешающая способность современных электронных микроскопов составляет 0,2—0,4 нм, рабочее увеличение в сред­нем - 100 000 раз.

Трансмиссионный электронный микроскоп.Трансмиссионный (от лат. transmissio — передача, переход) микроскоп широко применяют в биологических исследованиях. Каждый электронный микроскоп состоит из электронной пушки (источник электронов); электромагнитных катушек, вы­полняющих роль конденсорной, объективной и проекционной линз; предметного столика; экрана для изображения и окуля­ра. Для работы микроскопа необходим вакуумный насос, так как движение электронов возможно только в вакууме. Элект­роны в трансмиссионном микроскопе движутся по такому же пути, как и лучи света в световом микроскопе.

При изучении под электронным микроскопом морфоло­гических особенностей клеток микроорганизмов исследуются целые клетки, для изучения ультраструктуры клеток — их сре­зы. Толщина срезов не должна превышать 0,8—0,9 мкм.

Сканирующий, или растровый, электронный микроскоп.Этот микроскоп дает объемное, почти трехмерное изображение исследуемого объекта. В сканирующих микроскопах под­вижный тонкий электронный луч очень быстро и последова­тельно обегает поверхность исследуемого объекта по квадрат­ному растру и передает полученную информацию на электронно-лучевую трубку, покрытую люминофором, светя­щимся под действием электронов. Глубина фокуса сканирую­щего микроскопа достигает нескольких миллиметров; пределы полезного увеличения — 10—15 тыс. раз, разрешающая способность меньше, чем у трансмиссионных электронных мик­роскопов.

Препараты для сканирующего микроскопа подвергают специальной обработке, основная цель которой — обезвожи­вание объекта без нарушения (сморщивания) поверхности структур. Затем препарат покрывают тонким слоем сплава зо­лота или платины, что делает его поверхность электропро­водной и позволяет избежать накопления электрического за­ряда, который может снизить разрешающую способность мик­роскопа.

Контрольные вопросы:

1. Порядок выполнения работ в микробиологической лаборатории.

2. Строение светового микроскопа.

3. Правила работы с микроскопом.

4. Виды микроскопии.