Бактериологическая диагностика чумы

ЗАНЯТИЕ 17

ТЕМА. Возбудители зоонозных заболеваний: Туляремия, бруцеллез, сибирская язва. Francisella tularensis,Brucella, Bacillus anthracis. Морфология, биология, культуральные свойства возбудителей туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы. Лабораторный диагноз туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы. Специфическая профилактика туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы

Цель занятия. Ознакомить с основными свойствами возбудителей Francisella tularensis, Brucella, Bacillus anthracis. Рассмотреть эпидемиологию туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы. Разобрать этапы бактериологической диагностики туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы. Ознакомиться с препаратами, применяемыми для специфической профилактики, лечения туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы

Методические указания к практической работе

Продолжительность занятия: 3 академических часа (135 минут)

Место проведения занятия: учебная аудитория

Материально-техническое оснащение – таблицы, стенды, микроскопы, микропрепараты, вакцины

Хронометраж практического занятия:

1. Вводное слово преподавателя – 5 мин

2. Проверка исходного уровня знаний (тест-контроль) – 15 мин

3. Разбор теоретических вопросов по теме «Возбудитель бруцеллеза» – 20 мин

a. Морфология, биологические свойства бруцелл

b. Эпидемиологические особенности бруцеллёза

c. Патогенез бруцеллёза

d. Исследуемый материал при бруцеллезе

e. Лабораторная диагностика бруцеллёза

f. Специфическая профилактика бруцеллёза

4. Разбор теоретических вопросов по теме «Возбудитель туляремии» – 20 мин

a. Морфология, биологические свойства возбудителя туляремии

b. Эпидемиологические особенности туляремии

c. Патогенез туляремии

d. Исследуемый материал

e. Лабораторная диагностика туляремии

f. Специфическая профилактика туляремии

5 . Разбор теоретических вопросов по теме «Возбудитель сибирской язвы» – 20 мин

a. Морфология, биологические свойства возбудителя сибирской язвы

b. Эпидемиологические особенности сибирской язвы

c. Патогенез сибирской язвы

d. Исследуемый материал

e. Лабораторная диагностика сибирской язвы

f. Специфическая профилактика сибирской язвы

6. Выполнение практической работы

Практическая работа

Возбудитель туляремии

1. Изучение палочек туляремии в мазке из органов (зарисовать)

Туляремийная палочка при бактериоскопическом исследовании обнаруживается в мазках-отпечатках из органов, окрашенных по Романовскому-Гимзе. Бактерии туляремии представляют собой очень мелкие микроорганизмы коковидной или палочковидной фор­мы, окрашенные в красновато-фиолетовый цвет на фоне клеточных элементов органов, окрашенных в фиолетовый цвет.

2. Знакомство со схемой лабораторного диагноза туляремии(зарисовать схему 7, оформить протокол)

Бактериологические, серологические исследования проводятся в лаборатории отдела ООИ.

2.1. Аллергические методы диагностики

2.1.1. Внутрикожная проба с тулярином (положительная с 4–6 дня болезни). После в/кожного введения тулярина 0,1 мл учет реакции через 24 и 48 часов. Если гиперемия и инфильтрат не менее 0,5 см – проба положительная. При появлении только гиперемии и исчезновении ее через сутки – проба расценивается как отрицательная
2.1.2. Реакция лейкоцитолиза (РЛ) – аллергический метод диагностики.

Аллергическая реакция на введение может вызвать ухудшение состояния больного. Поэтому н/кож, в/к проба с тулярином должна применяться с осторожностью.

2.2. Серологические методы диагностики:

2.2.1. РА – диагностический титр 1:100 и выше (с 10–15 дня болезни)
2.2.2. РМА (реакция микроагглютинации).

2.2.3. РПГА – диагностический титр 1:100 и выше (с 7–10 дня болезни)
2.2.4. ИФА (с 6–10 дня болезни) – диагностический титр 1:200 и выше
2.2.5. РНИФ – титр 1:40 и выше.

При отрицательной, сомнительной реакции, при низких разведениях сыворотки – повторное исследование в динамике, вторая сыворотка – через 7–10 дней после первой. Нарастание титра антител в 2–4 раза и выше свидетельствует о свежем случае туляремии и подтверждении диагноза. Максимальное нарастание титра антител достигает на 4–6 неделе болезни.

2.3. Бактериологический метод диагностики:

Посев на питательные среды. Материал для исследования являются: пунктат бубона, соскоб со дня язвы, кровь, отделяемое конъюнктивы. Посеву, как правило, предшествует биологический метод. Биологическая проба – заражение лабораторных животных в/брюшинно и п/к (белые мыши, морские свинки). Реакция иммунофлюоресценции (РИФ), прямой метод.

3. Знакомство с препаратами для специфической диагностики, профилактики и лечения туляремии(записать в тетрадь)

1). Живая туляремийная вакцина (Н.А. Гайский, Б.Я.Эльберт). Живая туляремийная вакцина представляет собой взвесь куль­турывакцинного штамма, выращенного на искусственной питательной среде и высушенного в условиях вакуума. Вакцинный штамм получен путем лабораторного ослабления вирулентности возбудителя, содержит уменьшенное количество Vi -антигена, обладает высокой иммуногенностью и безвреден для человека. Вакцина вводится накожно или внутрикожно. Создает иммунитет длительностью 6 лет. Вакцинация осуществляется планово в природных очагах туляремии, по эпидемическим показаниям лицам, выезжающим в эндемичные районы илиработникам предприятий, перерабатывающих сырье из эндемичных районов (зерно, солома, шкурки животных).

2. Тулярин (туляремийная аллергия). Тулярин выпускают для внутрикожной и накожной пробы. Для постановки внутрикожной пробы применяют корпускулярный тулярин – убитая нагреванием взвесь бактерий в изотоническом растворе натрия хлорида с добавлением 3% глицерина; в 1 мл препарата содержится 500 млн. микробных клеток, поэтому он прозрачен. Для постановки накожной аллергической пробы используют тулярин, в 1 мл, которого содержится 10 млрд. убитых микробных клеток, поэтому препарат мутный.

Возбудитель бруцеллеза

1. Изучение мазков из чистой культуры бруцелл окрашенный по Граму (зарисовать)

В мазке из чистой культуры бруцелл видныв виде очень мелкихмикробов шаровидной илиовоидной формы, грамотрицательные, без какой-либо определенной группировки.

2. Знакомство со схемой патогенеза бруцеллеза (записать в тетрадь схема 6 патогенез бруцеллеза)

3. Знакомство со схемой лабораторного диагноза бруцеллеза(зарисовать)

3.1. Бактериологический метод. Решающим в диагностике является получение культур возбудителя из крови, костного мозга, реже из желчи, мочи, лимфоузлов, мокроты, слизи, пунктата селезенки. Однако бактериологический метод трудоемкий и длительный, его проведение возможно лишь в специальных лабораториях. Необходимо отметить, что диагностическая ценность метода особенно велика в остром и подостром периодах бруцеллеза, тогда как для диагностики хронического бруцеллеза результаты его имеет второстепенное значение.

а) миелокультура

б) гемокультура

3.2. Биологический метод диагностики применяют для выяснения культур бруцелл из материала, загрязненного посторонней микрофлорой (мочи, кала, молока, трупов, пищевых продуктов и т.д.), а так же при малой концентрации бруцелл в исследуемом материале. Наиболее восприимчивы к бруцеллезной инфекции морские свинки и белые мыши.

3.3. Серологические методы диагностики:

• РА Хеддльсона: применяют для ускорения серологической диагностики. В основе её лежит использование цельной сыворотки и антигена в концентрированном виде. Реакция специфична, становится положительной в раннем периоде заболевания и держится довольно долго. Преимущество пластинчатой РА перед пробирочной реакцией Райта состоит в том, что её можно провести в любой лаборатории и быстро получить результат. В связи с этим она может использоваться для массовых обследований людей (скрининг).

• РПГА используется в сомнительных случаях хронического и субклинического бруцеллёза. Диагностический титр – 1:200.

• РАРайта: положительный результат получают уже на 3–5 день болезни, антитела определяются в высоких титрах через неделю. Реакция Райта имеет большую диагностическую ценность при остром и подостром бруцеллезе. Достоверным считается титр антител в исследуемой сыворотке не менее 1:200 с последующим его нарастанием.

• РСК: имеет большую ценность в диагностике обострений хронического бруцеллеза в период ремиссий после обострений, а также при стертых формах и в тех случаях, когда реакция Райта положительна только в низких титрах или отрицательна. Однако в связи с громоздкостью сложностью применения РСК в обычных условиях ограничено.

• Проба Кумбса: основана на выявлении неполных антител с применением антиглобулиновой сыворотки. Высокая чувствительность пробы Кумбса при бруцеллезе доказана не только у больных, но и у людей, находящихся в контакте с инфекционным материалом или животными. Антиглобулиновая проба Кумбса применяется при хронических и латентных формах бруцеллеза.

• ИФА – выявление специфических IgM и IgG антител. Высокий титр указывает недавнее заражение, а высокий титр специфических – на активное заболевание.

3.3. Аллергическая диагностика:

Проба Бюрне. Основана на способности организма, сенсибилизированного бруцеллезным антигеном, специфически отвечать местной реакцией на внутрикожное введение аллергена. Бруцеллин (0,1 мл) вводится обычно в с/з ладонной поверхности кожи предплечья. Проба считается положительной при наличии в месте введения фильтрата отечности, появляющейся через 8 часов и позже и сохраняющейся 48–72 часа, гиперемия и болезненность необязательны. Реакцию учитывают динамически через 24–48 часов, измеряют размер отека в сантиметрах: при отеке до 1 см пробу считают сомнительной, от 1 до 3 см – слабоположительной, более 6 см – резко положительной.

Время появления реакции при бруцеллезе колеблется от 5 дней до нескольких месяцев. С переходом бруцеллеза в хроническую стадию реакция бывает положительной у многих больных.

Реакция лизиса лейкоцитов – аллергодиагностика in vitro (с бруцеллином). Показатель специфического лизиса лейкоцитов (ПСЛ) подсчитывают путем определения разницы между процентом уменьшения лейкоцитов в опытной пробирке (с бруцеллином) и процентом уменьшения лейкоцитов в контроле. ПСЛ оценивается следующим образом: 21% и более – результат резко положительный, 14–20 – результат положительный, 7–13 – результат слабо положительный, менее 7% – результат отрицательный.

4. Знакомство с препаратами для специфической диагностики, профилактики и лечения бруцеллеза(записать в тетрадь)

Специфическая профилактика – живая бруцеллёзная вакцина. Вакцина представляет собой взвесь живой культуры вакцинного штамма бруцелл абортус I9-ВA, высушенную ме­тодом сублимации.

Схема 6

Вакцину применяют длявакцинации и ревакцинаций людей про­тив бруцеллеза. Показанием к введению вакцины является наличиебруцеллезной инфекции у мелкого рогатого скота или выделение бруцелл овечьего вида от других животных. Вакцинация проводится в районах, где имеется заболеваемость бруцеллёзом среди животных. Иммунопрофилактике подлежат лица, обслуживающие сельскохозяйственных животных, и работники предприятий по обработке продуктов животноводства. Иммунитет на введение вакцины формируется к концу 1-го месяца, сохраняя наивысшую на­пряженность в течение последующих 1–2 лет.

Бруцеллезная лечебная вакцина. Лечебная вакцина представляет собой взвесь убитых нагреванием бруцелл овечьего и коровьего видов. Вакцину используют при лечения больных бруцеллезом в острой, подострой ихронической формах. Вводят еевнутривенно или внутрикожно. Введение вакцины активирует иммунную систему организма иповышает эффективность антибактериальной терапии.

Бруцеллин (аллерген) для постановки кожно-аллергической пробы Бюрне. Бруцеллин представляет собой фильтрат З-недельной убитой нагреванием бульонной культуры бруцелл овечьего, коровьего и свиного видов. Это прозрачная жидкость светло-желтого цвета. Исполь­зуется для постановки внутрикожной пробы Бюрне.

Экстренная профилактика – назначают внутрь в течение 10 дней рифампицин (по 0,3 г 2 раза в день), доксициклин (по 0,2 г 1 раз в день), тетрациклин (по 0,5 г 3 раза в день).

Возбудитель сибирской язвы

1. Изучение палочек Bac.anthracis в мазках-отпечатках, окрашенных по Граму из органов белых мышей (зарисовать)

В препарате видны грамположительные палочки, длина которых достигает или превышает диаметр клеток ткани органа, распо­лагающиеся попарно или в виде коротких цепочек, окруженные кап­сулой.

2. Изучение мазка из чистой культуры Bac.anthracis, окрашенного по Ожешко(для обнаружения спор)

Бациллы сибирской язвы образуют споры овальной фермы, распо­ложенные в центре и не превышающие поперечника микробной клетки. В препарате, окрашенном по методу Ожешко, споры приобретают крас­ный цвет, а тело бактерий - синий.

З_. Изучение колоний вакцинного штамма возбудителя сибирской язвы(зарисовать)

На МПА видны крупные серебристо-серые, зернистые, с неров­ным краем колонии (R-форма). При изучении колоний под микроскопом с небольшим увеличением наблюдают отходящие от краев колонии пуч­ки нитей, имеющих сходство с переплетенными косичками или их обычно сравнивают с "львиной гривой» или с «головой Медузы Горгоны» (зарисовать).

Схема 7

Бактериологическая диагностика туляремии

Кожная реакция ГЗТ (проба с тулярином)

Схема 8