Методы, используемые для изучения нативных препаратов

Метод «раздавленной» капли. На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за край покровного стекла. Микроскопируют препарат с объективом 40х.

Метод «висячей» капли. Препарат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят одну каплю бактериальной культуры. Затем предметное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. Для микроскопии вначале используют сухой объектив 8х, под увеличением которого находят край капли, а затем устанавливают объектив 40х и исследуют препарат.

Прижизненная (витальная) окраска. Взвесь микроорганизмов вносят в каплю 0,001% раствора метиленового синего или нейтрального красного. Затем готовят препарат «висячая» или «раздавленная» капля и микроскопируют. После микроскопии препараты «висячей» или «раздавленной» капли опускают в дезинфицирующий раствор.

Методика окраски жгутиков по Лёффлеру

1. Препарат готовят из 18-24-часовой культуры. Материал берут поблизости от конденсационной воды, переносят в пробирку с 1-2 мл стерильной водопроводной воды, осторожно погружая его, не разбалтывая; пробирки выдерживают 30-60 минут при комнатной температуре. Затем взвесь бактерий переносят в каплю воды на предметном стекле, высушивают.

2. Обрабатывают 15-20 минут протравой: 1 мл спиртового раствора фуксина + смесь из 10 мл 25% водного раствора танина с 5 мл насыщенного водного раствора сернокислого железа (протраву готовят за несколько суток до применения, перед использованием её фильтруют).

3. Промывают водой, высушивают на воздухе.

4. Докрашивают фуксином Циля 3-4 минуты при легком подогревании (без отхождения паров).

5. Промывают водой, высушивают над пламенем спиртовки. Жгутики и клетки окрашиваются в розовый цвет.

Методика окраски жгутиков по Морозову

1. Приготовленный препарат обрабатывают кислотой, при этом оболочка клетки и жгутики разрыхляются.

2. Закрепление разрыхленных структур танином.

3. Обработка азотнокислым серебром (оно окутывает каждый жгутик и саму клетку толстым слоем, давая различные оттенки от жёлтого до тёмно-коричневого).

К работе № 4

В цитоплазме бактерий находятся включения: гранулы волютина, липопротеидные тельца, гликоген, гранулеза, сера, кальций и др. Волютин состоит из неорганических полифосфатов, полиметафосфатов, встречается у некоторых бактерий и дрожжей. В дрожжевой клетке волютин можно обнаружить в виде большой круглой капли внутри вакуоли. При состоянии активного обмена волютин в клетках располагается мелкими каплями по стенкам вакуоли или непосредственно под клеточной стенкой. В большом количестве волютин накапливается перед почкованием. У дифтерийной палочки зерна волютина располагаются на полюсах клетки, и их обнаружение имеет дифференциально-диагностическое значение.

Методика окраски волютина по Лёффлеру

1. Приготовленный препарат фиксируют, наливают 1-2 капли метиленового синего.

2. Через 3 минуты краситель смывают водой и накрывают препарат покровным стеклом.

При микроскопировании волютин в виде капель окрашен в сине-фиолетовый цвет, а цитоплазма – в голубой. Если сбоку подвести каплю 1%-ной серной кислоты, происходит обесцвечивание всей клетки, за исключением волютина.

Методика окраски волютина по Нейссеру

1. Фиксированный мазок окрашивают ацетатом синьки Нейссера в течение 2-3 минут.

2. Наносят раствор Люголя на 10-30 с.

3. Окрашивают везувином или хризоидином в течение 0,5-1 мин.

4. Промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Зёрна волютина представляют собой соединения, имеющие в отличие от цитоплазмы щелочную реакцию, и поэтому избирательно воспринимают ацетат синьки, окрашиваясь в тёмно-синий или тёмно-коричневый цвет. Цитоплазма клетки, обладающая кислой реакцией, воспринимает щелочной краситель – везувин и окрашивается в жёлтый цвет.

к самостоятельной работе