Сушка, контроль и расфасовка препарата

После выделения и химической очистки антибиотика его необхо­димо высушить, т. е. удалить из препарата свободную и связанную воду. Поскольку большинство антибиотиков в той или иной степени термола­бильны, для их высушивания применяют методы, не приводящие к по­тере биологической активности, не изменяющие цвета препарата. На со­временном этапе промышленного получения антибиотиков используют следующие методы обезвоживания. Это:

• Лиофильная сушка антибиотиков - широко распространен­ный метод, он проводится при сравнительно низких температурах (-8 - - 12 ^оС).

• Высушивание с применением распылительной сушилки - прогрессивный метод при работе с большими количествами антибиоти­ка, раствор антибиотика пневматически распыляется до мельчайших ка­пель в камере с потоком нагретого воздуха. Процесс высушивания анти­биотиков занимает несколько секунд, при этом даже термолабильные препараты не меняют свойств.

• Метод взвешенного слоя (или сушка в вакуум-сушильных шкафах) применяется для высушивания зернистых и пастообразных антибиотических препаратов.

Контроль препарата

Готовый антибиотик подвергается тщатель­ному контролю: биологическому и фармакологическому.

При биологическом контроле ставится задача выяснения стериль­ности готового препарата. Для этого обычно используют два метода.

Первый связан с инактивацией антибиотика и высевом его в соот­ветствующую питательную среду. Например, биологический контроль бензилпенициллина и полусинтетических препаратов, полученных на его основе, проводится следующим образом. В пробирки, содержащие тиогликолевую среду, вносят фермент пенициллазу в количестве, спо­собном полностью инактивировать пенициллин. Пробирки с пеницилла-зой выдерживают двое-трое суток при температуре 37 ^оС для контроля стерильности фермента, затем в них вносят раствор пенициллина. Про­бирки разделяют на две группы: одну выдерживают при 37 ^оС, а другую - при 24 ^оС в течение пяти суток. Ведут ежедневное наблюдение за воз­можным развитием микроорганизмов.

Второй метод выяснения стерильности антибиотиков определяет­ся тем, что для большинства этих соединений не имеется инактиваторов их биологической активности. Поэтому у изучаемых препаратов выяв­ляют устойчивые к ним формы микроорганизмов, а также определяют возможное присутствие чувствительной микрофлоры. Для определения возможного присутствия в таких препаратах чувствительной к ним мик­рофлоры раствор антибиотика пропускают через мембранные фильтры с диаметром пор не более 0,75 мк.

Фармакологический контроль.

К антибиотическим веществам, ис­пользуемых в медицинской практике, в соответствии с Государственной Фармакопеей предъявляются очень строгие требования. Каждый новый лекарственный препарат, прежде чем он будет разрешен к практическо­му применению, должен пройти всесторонние испытания на токсич­ность, пирогенность и другие свойства, жизненно важные для организ­ма. Препарат изучают на разных видах животных в отношении его острой и хронической токсичности (влияние на кровь, ЦНС, дыхание и т. д.). Показатели острой токсичности - один из критериев качества ан­тибиотического вещества. Устанавливают максимально переносимую дозу (МПД) антибиотика; дозу, вызывающую гибель 50 % подопытных животных (LD₅₀) и смертельную дозу (LD₁₀₀). Только после всесторон­него и тщательного изучения препарата он может быть рекомендован к практическому применению.

Расфасовка и упаковка антибиотика - завершающий этап работы.

Расфасованный и упакованный антибиотик с указанием показателя био­логической активности, даты выпуска и срока годности поступает в продажу.

Обобщая весь многостадийный и многоступенчатый процесс по­лучения антибиотика, можно отметить, что он включает в себя четыре основные стадии:

I стадия - получение соответствующего штамма, продуцента

антибиотика, пригодного для промышленного производства;

II стадия непосредственно связана с процессом биосинтеза анти­биотика;

III стадия - это процессы выделения и очистки образовавшегося в ходе биосинтеза антибиотика;

IV стадия включает в себя операции, связанные с концентрацией антибиотика, его стабилизацией и получением готового продукта.

Производство пенициллинов

В 1871 г. В .А. Манасеиным было установлено, что зеленая пле­сень Penicillium glaucum при своем росте уничтожает бактерии, попа­дающие в культуральную среду. Это свойство Penicillium было тогда же использовано врачом А. Г. Полотебневым, применившим смоченные этой плесенью повязки при лечении гнойных ран и язв.

Выдающееся открытие русских ученых не получило широкой из­вестности, и в 1928 г. англичанин Александр Флеминг вторично обна­ружил способность плесневого грибка Penicillium угнетать рост микро­организмов. Было показано, что вызываемая плесенью гибель микробов обусловлена образованием неизвестного органического вещества, названного пенициллином.

Однако выделение пенициллина в чистом виде в то же время осу­ществлено не было, так как он оказался веществом очень лабильным, а применявшиеся методы очистки были несовершенны.

В годы Второй мировой войны огромная практическая потреб­ность в эффективных антибактериальных препаратах привлекла к пени­циллину внимание широкого круга специалистов, и примерно с 1939 г. начался период интенсивных исследований. Благодаря этому в относи­тельно короткий срок (3-5 лет) англичанами Х. Флори и А. Чэттеном были разработаны способы промышленного получения и очистки пени­циллина, изучены его лечебные свойства и методы клинического при­менения, а также установлена его химическая структура.

К пенициллинам относится группа близких по химическим свой­ствам соединений, содержащих в своей структуре b-лактамное и тиазо- лидиновые кольца:

R может иметь различные значения, в зависимости от типа пени­циллина. Например, при R = -CH₂C₆H₅ - это бензилпенициллин; R = - СН₂-О-С₆Н₅ - это феноксиметилпенициллин и т. д. Наличие кар­боксильной группы придает молекуле пенициллина сильные кислотные свойства, поэтому пенициллин легко образует соли со щелочами (Na, K), а также с органическими основаниями, например с дибензилэтилендиамином (препарат - бициллин).

Для практических целей медицины пенициллин получают в про­мышленности путем биосинтеза.

Процесс биосинтеза складывается из следующих стадий:

1) выращивания посевного материала (микроорга­низмов) в аппаратах малой емкости - инокуляторах;

2) выращивания посевного материала в больших посевных аппаратах;

3) процесса фер­ментации;

4) выделения антибиотика из культуральной жидкости и его очистки.

Важное значение имеет также селекционный подбор высокопро­изводительных штаммов плесени, подготовка и стерилизация питатель­ной среды и аппаратуры.

Очень важное значение для высокого выхода пенициллина имеет питательная среда, примерный состав которой (в %) следующий:

Кукурузный настой - 3 (по объе­му)	Сульфат цинка - следы
Лактоза (или глюкоза) - 2 (по ве­су)	Карбонат кальция - 0,25
Нитрат натрия - 0,6	Магний сернокислый гептагидрат - 0,05
Калий фосфорнокислый (одноза- мещенный) - 0,15	Вода ~90

Вместо какурузного настоя успешно применяется мука из хлопко­вых семян или мясные гидролизаты.

Приготовленную питательную среду подвергают стерилизации. Процесс ведут в колоннах непрерывного действия. Далее питательная среда поступает в аппарат-выдерживатель, где охлаждается в течение определенного времени до температуры 23-25 ^оС.

Первая стадия процесса - выращивание стандартной колонии штаммов плесени Penicillium chrysogenum - проводится в инокуляторах на питательной среде, где процесс идет ~30 часов. Подготовленный инокулят передают в посевной аппарат, объем которого ~ в 10 раз больше объема инокулятора. В посевном аппарате находится также сте­рилизованная питательная среда. Процесс роста здесь идет ~15-20 ча­сов, и далее посевной материал передается на ферментацию в большие реакторы - ферментаторы объемом до 100 м на питательную среду. Процесс ферментации идет ~70 часов при температуре 23-24 ^оС, рН среды 6-6,5 и постоянной аэрации воздуха - 1 л воздуха/1 литр пита­тельной среды/1 мин по всему объему ферментатора. Основная задача этого процесса - создание оптимальных условий для развития продуцента и накопления антибиотика. Биосинтез анти­биотика - двухфазный процесс. В течение первой фазы происходит быстрый рост и размножение мицелия или бактериальных клеток. Куль- туральная жидкость в этот период богата углеводами, азотом и неорга­ническим фосфором. Продукты обмена веществ микроорганизмов, в том числе и антибиотики, находятся в малых количествах.

Вторая фаза начинается с момента замедления роста культуры. Протекает она в культуральной жидкости, обогащенной продуктом жизнедеятельности организма с небольшим количеством углеводов и фосфора. В начале этой фазы мицелий обладает максимальной способ­ностью к синтезу антибиотика. Фазы отличаются характером и интен­сивностью биохимических реакций. С учетом этих различий подбирают условия, благоприятные для первой и второй фаз развития продуцента.

Для увеличения выхода антибиотика в питательную среду вводят «предшественники», т. е. химические вещества, способствующие целе­направленному синтезу антибиотика. Так, в питательную среду при биосинтезе пенициллина вводят «предшественник» фенилацетамид - это увеличивает выход антибиотика более чем в 2 раза.

По окончании процесса ферментации культуральную массу пере­дают на процесс выделения антибиотика.

Рис. 3 Схема производства антибиотиков в процессе микробного синтеза

Большинство продуцентов при биосинтезе выделяют антибиотик в водную фазу, поэтому процесс выделения антибиотика начинается с разделения твердой и жидкой фаз.

Твердая фаза, кроме массы мицелия, содержит значительное ко­личество коллоидных примесей, затрудняющих фильтрование, поэтому культуральную массу предварительно подвергают различным типам ко­агуляции (электролитической, тепловой, кислотной и т. д.). Наиболее эффективным методом коагуляции культуральной массы является ее обработка флокулянтами (высокомолекулярными полиэлектролитами), например, поли-(4-винил)-Ы-бензилтриметиламмонийхлоридом.

Оставшийся от фильтрации мицелия водный раствор антибиотика направляют на химическую очистку и выделение.

Таким образом, водный раствор пенициллина направляют после фильтрации на экстракцию бутилацетатом при рН водной среды, равной 2. При таком значении кислотности среды подавляет кислотная иониза­ция пенициллина в водной фазе и он переходит в органическую фазу (в бутилацетат). Реэкстракцию пенициллина из бутилацетата проводят слабыми растворами щелочей.

Широко применяются сорбционные методы выделения и очистки антибиотиков. В качестве сорбентов широко используются синтетиче­ские ионообменные смолы.

Сушат пенициллины методом сублимации или распыления.

Широкое и успешное использование антибиотиков в медицине привело к их использованию и в других областях, в том числе:

- в ветеринарии (с теми же целями, что и в медицине);

- для борьбы с некоторыми болезнями растений бактериального и грибкового происхождения;

- в качестве добавки к кормам животных, так как они ускоряют рост и увеличивают степень превращения кормов в мясо;

- в качестве консервантов скоропортящихся продуктов;

- для подавления бактериальной флоры при осуществлении раз­личных процессов при производстве вакцин.

Наука об антибиотиках продолжает быстро развиваться. С одной стороны, продолжаются поиски новых, еще более эффективных препа­ратов биотехнологии, в том числе с иммуностимулирующим, противо­опухолевым, противовирусным действием, с другой стороны, расширя­ются работы по химическому синтезу производных этих веществ и хи­мической модификации природных антибиотиков.