Конструирование штаммов с повышенной способностью к трансформации

Изучение нехромосомных элементов наследственности, конт­ролирующих катаболизм у микроорганизмов многих органиче­ских веществ («плазмиды биодеградации»), навело на мысль об использовании их для создания «улучшенных» штаммов, транс­формирующих органические соединения. Принципиальная воз­можность этого подхода показана на примере окисле­ния нафталина в салициловую кислоту.

Процесс получения салициловой кислоты из нафталина с помощью бактерий рода Pseudomonasбыл описан достаточно давно. Недостатком исходных штаммов было то, что салициловая кислота после крат­ковременного накопления в среде потребляется культурой в каче­стве источника углерода, что значительно снижает производительность про­цесса. Штамм Ps. putida 41, полученный методом конъюгации в результате переноса плазмиды NPL-1, контролирующей первич­ный этап окисления нафталина до салициловой кислоты, от донорного штамма Ps. puti­da 12А к реципиенту Ps. putida 4, не обладающему способностью окислять нафталин до салициловой кислоты, накапливал салици­ловую кислоту без ее дальнейшего потребления и отличался от донорного штамма значительно более высокой производительно­стью. В присутствии анионообменной смолы Амберлит IR-45, связывающей образующийся салицилат, в ферментационной среде выход продукта, равный 90 %, достигал­ся за 10 ч ферментации.

Ферментные препараты и иммобилизованные ферменты

Применение очищенных препаратов — логически наиболее естественный способ практического использования активности отдельных ферментов микробных клеток для трансформации органических веществ. Однако технически этот подход реализуем лишь в том случае, если ферментные препараты могут быть получены сравнительно легко, если ферменты стабильны и не тре­буют кофакторов и т. д.

Особенно широкие перспективы в использовании ферментов для синтеза различных соединений открываются в связи с разра­боткой методов их иммобилизации. Основные достоинства иммо­билизованных ферментов — возможность неоднократного исполь­зования, отсутствие необходимости очистки продукта от катали­затора, стабильность при хранении и в процессе использования, возможность вести реакцию в более широком диапазоне физико-химических условий, в непрерывных условиях и т. д. Реализация большого числа процессов трансформации углеводов, стероидов, антибиотиков, аминокислот с помощью иммобилизованных фер­ментов убедила в экономической перспективности этого метода. Кроме названных выше процессов, имеющих промышленное применение, представляет интерес получение L-аспарагиновой кислоты из фумарата аммония с помощью иммобилизованной в полиакриламидный гель аспартазы Escherichia coli. Фермент работает непрерывно длительное время (до 8 дней), не снижая активности, и количественно превращает субстрат при концент­рации фумарата 0,2 М и скорости протока 0,16 ч^-1. Сравнение с процессами, в которых участвовала растворимая форма фер­мента или интактные клетки Е.coli, показало экономическую целесообразность использования иммобилизованной аспартазы.

Иммобилизация клеток

Наряду с успешной иммобилизацией многих ферментов и применением этого метода в промышленности исследователи столкнулись с рядом трудностей, характерных для работы с фер­ментами, зависимыми от кофакторов, а также в тех случаях, когда трансформации осуществляются несколькими ферментами. Были предприняты попытки использовать активность «сложных» ферментов и ферментных комплексов путем иммобилизации кле­ток. Иммобилизация клеток позволяет эксплуатировать отдель­ные ферменты, а также их системы, что затруднительно при работе с иммобилизованными ферментами. Обмен иммобилизо­ванных клеток отличается от метаболизма интактных микроорга­низмов, что может быть использовано в целях регуляции транс­формации. Эффективность процессов, осуществляемых иммоби­лизованными клетками, в ряде случаев выше их эффективности, как у свободных микроорганизмов, так и у иммобилизованных ферментов. Для иммобилизации клеток используются почти все методы, применяемые для иммобилизации ферментов, но наибо­лее распространенным в настоящее время является включение в полиакриламидный (ПААГ) и каррагенановый гели.

Получение аминокислот и органических кислот с использо­ванием клеток, иммобилизованных в полиакриламидный и карра­генановый гели — один из примеров, демонстрирующих возмож­ности и перспективы метода. Клетки Е. coli, иммобилизованные в ПААГ, осуществляли превращение фумаровой кислоты в аспарагиновую. При этом активность иммо-билизованных клеток сохранялась при 37°С в присутствии ионов Mg⁺⁺ в течение 40 сут. при скорости прото­ка 0,5 мл/ч через колонку размером 10х100 см, причем выход аспартата достигал 95 %. Процесс был успешно применен в промыш­ленном масштабе. Ежесуточный выход кислоты при использова­нии промышленной колонки 1900 кг или 57,6 т/мес, время полу­жизни и активность клеток свыше 120 сут. Позже был разрабо­тан более экономичный способ иммобилизации клеток в карра­генан. Продуктивность иммобилизованных в каррагенан клеток в 15 раз превышала таковую для иммобилизованных в ПААГ, вре­мя полужизни их также увеличилось до 2 лет. Преимущества метода были так велики перед существовавшим ранее, что фирма “Танабе” в 1979 г. заменила им промышленное получение L-acnaрагиновой кислоты. Такой же процесс был осуществлен в Советском Союзе.

Получение L-яблочной кислоты из фумаровой с помощью иммобилизованных в каррагенан клеток Brevibacterium [iuvum— второй пример промышленного использования ферментативной активности микроорганизмов для биоконверсии органических соединений.

Пристального внимания заслуживает и метод иммобилизации смешанных культур. Так, осуществлена трансформация сорбозы в 2-кето-L-гулоновую кислоту смесью иммобилизованных в ПААГ клеток Gluconobacter melanogenusIFO 3293 и Pseudomonas syringaeNRRL B-865. Первая бактерия окисляла сорбозу в сорбозон, а вторая, обладая активной сорбозоноксидазой, обра­зовывала 2-кето-L-гулоновую кислоту.

Политрансформации

Трансформация сложных органических молекул часто предпо­лагает более чем одну ферментативную реакцию. В ряде случаев для получения практически ценных продуктов требуются весьма существенные перестройки молекулы субстрата, которые могут включать различные процессы, например окисление и гидролиз или окисление, восстановление и гидролиз и т. д. Эти задачи могут быть решены разными путями.