Условное разделение методов in vitro в селекции растений на 2 группы

Первая группа — это вспомогательные технологии, которые не подменяют обычную селекцию, а служат ей. К ним можно отнести: оплодотворение in vitro (преодоление прогамной несовместимости), культивирование семяпочек и незрелых гибридных зародышей (преодоление постгамной несовместимости), получение гаплоидов путем культивирования пыльников и микроспор. Вторая группа методов ведет к самостоятельному, независимому от традиционных методов селекции, получению новых форм и сортов растений: клеточная селекция с использованием каллусной ткани, соматическая гибридизация (слияние изолированных протопластов и получение неполовых гибридов), применение методов генной инженерии. В отдаленной гибридизации находят применение такие методы культуры изолированных тканей, как оплодотворение in vitro, эмбриокультура (выращивание изолированных зародышей на искусственных питательных средах), а также получение гаплоидов in vitro и криосохранение.

Факторы, влияющие на сомаклональную изменчивость:Сомаклональная изменчивость (вариабельность) — это изменчивость, наблюдаемая в культурах тканей и клеток. Высокий уровень изменчивости клеток связан с действием нескольких факторов: генетической неоднородностью клеток исходного экспланта, влиянием компонентов питательных сред (прежде всего гормонов), условий культивирования. Растения, полученные из культур тканей и клеток, называют сомаклонами (соматическими клонами), а в случае появления у них измеений — сомаклональными вариантами. Изменчивость, проявляющаяся в культурах тканей, может быть усилена дополнительной обработкой физическими и химическими мутагенами.

Ферменты генетической инженерии и особенности их использования для получения рекомбинантных ДНКФерменты генетической инженерии - это ферменты, позволяющие проводить различные манипуляции с молекулами ДНК: разрезать в определенных местах, соединять различные по происхождению фрагменты, синтезировать новые, не существующие в природе последовательности, и т.д. Рассмотрим основные ферменты генетической инженерии. ДНК-полимеразы.Одним из наиболее часто используемых в генетической инженерии ферментов является ДНК-полимераза. ДНК-полимераза I обладает способностью удлинять цепь ДНК в направлении 5м> 3 м путем присоединения комплементарного нуклеотида. Это свойство ДНК-полимераз используется в генной инженерии для построения второй комплементарной цепи. ДНК-лигаза осуществляет одну функцию - соединение фрагментов ДНК путем восстановления фосфодиэфирных связей между соединениями нуклеотидами. Этот процесс называется лигированием. Наиболее часто для лигирования в генной инженерии используют ДНК-лигазу фага Т4. с помощью лигазы Т4 соединяют любые фрагменты ДНК с любыми концами: «липкими» или «тупыми». Это один из наиболее часто использующихся ферментов. Нуклеазы-это большая группа ферментов, катализирующих реакцию гидролиза молекул нуклеиновых кислот. В результате действия нуклеаз молекула ДНК или РНК распадается на фрагменты или отдельные нуклеотиды. Исходная функция нуклеаз в клетке - деградация ненужных в данный момент жизнедеятельности молекул (например, деградация мРНК после трансляции) и защита от чужеродных молекул нуклеиновых кислот (расщепление фаговой ДНК бактериальными нуклеазами при заражении бактерии фагом). Рестриктазы группа ферментов, относящихся к классу гидролаз, катализирующих реакцию гидролиза нуклеиновых кислот.. Выделяют три основных типа ферментов рестрикции, сайты узнавания для которых могут быть симметричными (палиндромными) и несимметричными^[2]: Рестриктазы первого типа (например, ЕсоК из Escherichia coli К12) узнают определённую последовательность нуклеотидов и разрезают двухцепочную молекулу ДНК неподалёку от этой последовательности в произвольной точке и само место разреза не строго специально (по-видимому, после образования комплекса с ДНК фермент неспецифически взаимодействует с удалённой областью ДНК или передвигается вдоль цепи ДНК). Рестриктазы второго типа (например, EcoRI) узнают определённую последовательность и разрезают двойную спираль ДНК в определённой фиксированной точке внутри этой последовательности. Рестриктазы этого типа узнают палиндромные последовательности, которые обладают центральной осью и считываются одинаково в обе стороны от оси симметрии. Рестриктазы третьего промежуточного типа (например, EcoPI) узнают нужную последовательность и разрезают двухцепочную молекулу ДНК, отступив определённое число нуклеотидных пар от её конца (или в нескольких точках на разном удалении от сайта узнавания). При этом образуются фрагменты ДНК либо с ровными (тупыми) концами, либо с выступающими (липкими) 5'- или 3'-концами. Эти рестриктазы узнают асимметричные сайты.

Фитогормоны и гормональная регуляция процессов дифференцировки и дидефференцировки.Фитогормоны необходимы для дедифференцировкиклеток и индукции клеточных делений. Поэтому для получения каллусных тканей в состав питательных сред должны обязательно входить ауксины, вызывающие клеточную дедифференцировку, и цитокинины индуцирующие деление дедифференцированных клеток. В случае индукции стеблевогоморфогенеза содержание ауксинов может быть снижено или же они могут быть полностью исключены. На безгормональной среде растут опухолевые и «привыкшие» ткани. Автономность по отношению к обоим гормонам или к одному из них связана со способностью этих клеток продуцироватьгормоны.В качестве источников ауксинов в питательных средах используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), индолилуксусную кислоту (ИУК), a-нафтилуксусную кислоту (НУК). ИУК почти в 30 раз менее активна, чем 2,4-Д. Для индукции каллуса обычно необходимы высокие концентрации ауксинов (чаще это 2,4-Д), при последующих пересадках их уменьшают. В качестве источников цитокининов в питательных средах используют кинетин, 6-бензиламинопурин (6-БАП), 2- изопентениладенин (2ip), зеатин. 6-БАП и зеатин по сравнению с кинетином более активны в отношении поддержания роста изолированных тканей и индукции органогенеза. В состав некоторых питательных сред входит аденин.
Кроме веществ ауксинового и цитокининового типа действия в отдельные питательные среды включают гибберелловую кислоту (ГК), присутствие которой в среде не является обязательным, но в некоторых случаях она стимулирует рост изолированной ткани.

Фитогормоны и их использование в биоинженерии растений: Фитогормоны – это биологические регуляторы роста и развития растений, осуществляющие взаимодействие клеток, тканей и органов, стимулирующие и ингибирующие морфогенетические и физиологические процессы в растительных организмах. Фитогормоны влияют на деление и рост клеток растяжением, состояние покоя, созревание, старение, формирование пола, устойчивость к стрессу, тропизмы, транспирацию; обеспечивают функциональную целостность растительного организма, закономерную последовательность фаз индивидуального развития. По функциональному действию различают 5 основных групп фитогормонов: ауксины, цитокинины, гиббереллины, абсцизины и этилен. Ауксины в культуре тканей вызывают рост клеток растяжением, в больших концентрациях – деление клеток, в сочетании с цитокининами – органогенез. В биотехнологии применяют как природные ауксины (ИУК), так и синтетические [ИМК (индолил-З-масляная кислота), ИПК (индолил-Зпропионовая кисло-та), 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота), НУК(нафтилуксусная ки-слота)]. Цитокинины в сочетании с ауксинами индуцируют митозы, пролиферацию клеток, почек и побегов. К природным цитокининам относятся: зеатин, кинетин (6-фурфуриламинопурин), NN-дифенилмочевина (кокосовое молоко); к синтетическим – 6-БАП (6-бензиламинопурин). Гиббереллины стимулируют рост клеток растяжением, а также синтез ауксинов и цитокининов. Сейчас известно около 60 видов гиббереллинов. В культуре ткани используется гибберелловая кислота. Абсцизины (АБК – абсцизовая кислота) и этилен ингибируют ростовые процессы, деление клеток, в сочетании с цитокининами и хлорхолинхлоридом индуцируют органогенез (образование микроклубней).