Тема: Патогенные анаэробы - возбудители злокачественного оттека, эмфизематозного карбункула.

Цель занятия: Усвоить правила отбора и пересылки патологического материала для бактериологического исследования, отличительные особенности морфологи­ческих, культурально-биохимических свойств названных патогенные микробов и особенности их культивирования.

Задание:

1. Вскрыть труп морской свинки.

2. Сделать высев на среду Китта-Тароцци.

3. Сделать мазки-отпечатки.

4. Окрасить мазки простым методом.

5. Микрокартину зарисовать в тетради.

Материалы и оборудование: Трупы морских свинок павших после заражения культурой - С. chauvoei; питательные среды — МППБ Китта — Тароцци, глюкозно-кровяной агар (в чашках Петри), среда Вильсона — Блера, стерильные пасте­ровские пипетки, стерилизованные наборы инструментов в стерилизаторах для вскрытия трупов морских свинок (для каждой свинки отдельный комплект инст­рументов), склянки с дезраствором (3—5 %-ный фенол или лизол), вата гигро­скопическая; посевы с предыдущего занятия; микроанаэростаты (или эксикато­ры). Для демонстрации необходимы таблицы (морфология микробов-анаэробов, формы колоний), биопрепараты. Таблицы бактериологического исследования.

Классификация:

Отдел – Firmicutes;

Секция – 13, спорообразующие Г “+” палочки

Порядок – Eubacteriales;

Семейство – Bacillaceae;

Род – Clostridium;

Виды – Cl.perfringens, Cl.Septicum, Cl.oedematiens – возбудитель злокачественного отека, дизентерии ягнят, брадзота овец; Cl.chauvoei – Эмкар; Cl.tetani – столбняк; Cl.botulinum – возбудитель ботулизма.

Возбудители злокачественного отека — С. perfringens, С. septicum, С. novyi (oedematiens), С. histolyticum, а также С.sordellii, С. gigas и др. (каждый из них мо­жет быть в сочетании с другими анаэробами и аэробами). Злокачественный отек (газовая гангрена, раневой газовый отек) — острая неконтагиозная раневая инфекция, заболевание полимикробной этиологии, развивающееся вследст­вие проникновения микробов с раневой поверхности в глубь раны. Заболевание характеризуется быстро распространяющимся болезненным отеком мягких тканей, их разрушением, образованием в пораженных тканях газах и интоксикацией организма. Поражает животных и человека. У крс злокачественный отек может наблюдаться после отелов, сопровождающихся повреждениями и ранениями родовых путей, а также после абортов.

Патологический материал. Воспалительный экссудат и кусочки пораженной ткани из очага воспаления. Если материал нельзя быстро доставить в лабораторию, его консервируют в 40 %-ном водном растворе глицерина или же полоски нарезанной пораженной ткани в марлевом мешочке (защита от мух) высушивают на возду­хе. Перед исследованием материал растирают в стерильной ступке с добавлением физраствора (если материал консервирован глицерином, его предварительно про­мывают стерильным физраствором, затем растирают). Пипеткой Пастера высевают полученную взвесь в среду Китта-Тароцци, Вильсона-Блера, помещают в тер­мостат при +38 °С. Естественно, что первичный рост культуры будет смешанный, поэтому выросшие культуры пересевают на кровяной МПА (пластинчатый посев по методу Дригальского), что позволит при последующем пересеве отдельных коло­ний, характерных для того или иного вида возбудителей злокачественного отека, получить чистую культуру, с которой проводят дальнейшее исследование для ее идентификации в соответствии с характеристикой каждого из них.

Морфология Clostridium perfringens — это крупная полиморфная палочка с закругленными концами, длиной 4-8 мкм. Неподвижная, окрашивается грамположительно. В почве, воде, навозе образует спору; на средах бедных углеводами и богатых белками, споры образуются при длительном культивировании. Поэто­му иногда для активизации спорообразования к питательным средам добавляют мел. Споры крупные овальные, расположение центральное или субтерминальное. Перфрингенс — один из всей данной группы анаэробов образует капсулу в инфицированном организме. Капсула окружает микроб в виде светлого ободка, который хорошо виден

Рис.14 Clostridium perfringens в мазке

Культуральные свойства. Анаэроб. В жидкой среде Китта-Тароцци рост С. perfringens проявляется равномерным помутнением среды с обильным газообразованием. Через 2—3 дня микробная масса оседает на дно пробирки, бульон просветляется. Культура имеет запах маслянистой кислоты. На кровяном агаре растет в виде круглых, выпуклых, сочных, с ровными краями в начале сероватого, затем зеленого цвета ко­лоний, с обширной зоной гемолиза. На среде Вильсона — Блера образует черные колонии, мозговую среду не изменяет. Помимо обычно описываемых классических форм колоний и морфологии бактериальных клеток, следует учитывать вариабельность С. perfringens. Встречаются S-формы колоний, содержащие короткие палочки; при введении их в организм животного они не образуют капсулу. Иногда отмеча­ется рост слизистых М-форм колоний, бактерии из которых капсулообразующие, а также шероховатые R-формы колоний с неровными краями. В препаратах маз­ках из таких колоний видны нитевидные формы, цепочки. Колонии на глюкозно-кровяном агаре зеленого цвета, окружены зеленой зоной а-гемолиза (альфа-токсин, лецитиназа). Попадаются и смешанные колонии.

Ферментативные свойства. Чистую культуру микроба засевают в молоко, желатину (столбиком), среды с углеводами. Посевы помещают в микроанаэростат и выдерживают 16-18ч в термостате. Интенсивно проявляются сахаролитические свойства — перфрингенс ферментирует с образованием кислоты и газа лактозу, сахарозу, мальтозу, крахмал и не ферментирует дульцит и маннит. Типичным для этого микроба является характер свертывания молока — образуется губчатый сгусток казеина, и обилие газа под­нимает его вверх. Желатину и свернутую сыворотку разжижает медленно.

Биопроба. Внутримышечное (или подкожное) заражение вызывает гибель животных через 16—24 часа. Для биопробы используют морских свинок, голу­бей, кроликов, белых мышей.

Антигенное строение.С. perfringens продуцирует сложный экзотоксин, обладающий летальным, некротизирующим и гемотоксическим действием. По антигенной структуре разделяяют на 6 типов сероваров, обозначаемых заглавными буквами латинского алфавита — А, В, С, D, Е, F. Каж­дый из названных токсинов нейтрализуется гомологичной (типоспецифической) антитоксической сывороткой.

Серова типа А вызывает газовую гангрену у животных и человека, пищевые токсикоинфекции у людей, является возбудителем энтеротоксемии телят и свиней.

С. perfringens, продуцирующие токсин типа В является возбудителем анаэробной дизентерии у ягнят, козлят, телят, поросят и жеребят, цыплят.

Серовар типа С обусловливает некроти­ческий энтерит у поросят (со смертельным исходом), брадзот овец.

D-токсин вызывает энтеротоксемию овец («мягкая почка»), а также и кишечные заболевания у че­ловека.

Токсины А, С, D и Е могут быть причиной энтеротоксемии телят, гастро­энтерита у взрослого крупного рогатого скота, токсин С и F-токсин вызывает язвенный энтерит у овец и может быть при­чиной некротического энтерита у людей.

С. perfringens следует учитывать с общесанитарных позиций при проведе­нии бактериологических исследований кормов (санитарная оценка). Этот микроб может быть причиной пищевой интоксикации (токсикоинфекции) у человека.

Морфология С. septicum. Микроб палочковидной формы, длиной 2—8 мкм, шириной 0,8—1 мкм, подвижный (перитрих), капсулу не образует. Образует спо­ру как в почве, воде, так и на питательных средах и в инфицированном ор­ганизме. Спора обычно лежит центрально. Грамположительный. В мазках из культуры клетки располагаются одиночно или короткими цепочками, а в мазках с серозной поверхности печени, из экссудата — длинными нитями.

Культуральные свойства. С. septicum – строгий анаэроб. рН среды 7,6 (оптимальный), температурный оптимум +37—38 °С. В МППБ и полужидком агаре рост про­является равномерным помутнением и газообразованием. Через 48 часа микробная масса в жидкой среде оседает на дно пробирки и бульон просветляется, Хорошо рас­тет на мозговой среде, но не вызывает ее почернения. На глюкозно-кровяном агаре характерный рост колоний в виде кружевного узорчатого сплетения с большой зоной гемолиза. В агаре столбиком растет в виде нежных хлопьевидных колоний.

Биохимические свойства. Интенсивно выражены сахаролитические свойст­ва — сбраживает глюкозу, лактозу, левулезу, салицин с образованием кислоты и газа, маннит и сахарозу не ферментирует. Молоко свертывает медленно. При росте культу­ры в жидкой среде обнаруживают образование сероводорода, аммиака. Индол не образуется. Протеолитические свойства выражены слабо — медленно разжижает желатину и совсем не разжижает свернутую сыворотку.

Биопроба. С. septicum продуцирует высокоактивные экзотоксины, вызывающие гемолиз, нек­роз ткани, летальность. Патогенен для всех лабораторных животных, среди которых чаще используют морских свинок, заражая их молодой культурой в дозе 0,1 мл под­кожно или внутримышечно. Гибель животных наступает через 8—20 часов.

Для более быстрого воздействия микроба на организм животного целесооб­разно перед заражением применить 1 %-ный раствор молочной кислоты (0,5 мл вводят внутримышечно с внутренней стороны бедра — место последующего за­ражения). При вскрытии трупов морских свинок отмечают: на месте инъекции шерсть легко отделяется от прилегающих тканей, мышцы отечны, геморрагично инфильтрированы, обилие пузырьков газа. В грудной и брюшной полостях скоп­ление значительного количества жидкости. Из тканей и экссудата морской свин­ки делают высевы на питательные среды (для получения чистой культуры).

Морфология С. novyi (С. oedematiens). Крупная полиморфная палочка (4-10 мкм) с закругленными концами. Под­вижная, перетрих. Расположение одиночное или в виде коротких цепочек. На щелочных средах (и средах бедных питательными веществами) обра­зует спору, расположена субтерминально.

Грамположительна.

Культурально-биохимические свойства. Строгий анаэроб. Хорошо растет на среде Китта-Тароцци (равномерное помутнение). На глюкозно-кровяном агаре формирует ко­лонии сочные, крупные серого цвета с неровными краями, с небольшой зоной гемолиза. Нередко наблюдается появление дочерних колоний.

С. novyi неоднороден по антигенной структуре: различают его разновидно­сти А В, С, D. Первые три разновидности характеризуются ползучим ростом; D растет в виде мелких прозрачных колоний; тип А - ферментирует глицерин; типы В и D проявляют β-гемолиз на кровяном агаре. Типы А и В — продуцируют α-некротизирующий токсин, который является капиллярным ядом, нарушающим проницаемость стенок сосудов. Следствием действия этого токсина при под­кожном введении его кроликам развивается отек тестообразной консистенции. Серовар D (С. haemolyticum) вызывает инфекционную гемоглобинурию у крупного рогатого скота. Строгий анаэроб. Палочковидной формы, палочки крупные (более 6 мкм). Подвижный, образует спору (субтерминально). Окрашивается грамположительно. На плотной среде растет в виде колоний с ров­ными краями. В жидкой среде растет слабо, образуя хлопьевидный осадок. Фер­ментирует глюкозу. Молоко свертывает медленно. Слабо разжижает желатину. На средах с печенью и пептоном образует сероводород и индол.

Морфология Clostridium histolyticum. Тонкая палочка длиной 3—5 мкм, ши­риной 0,2—0,5 мкм, подвижная, капсулы не образует. Грамположительная. Спора образуется в старых культурах, располагается субтерминально.

Культурально-биохимические свойства. В МППБ (среда Китта-Тароцци) рост проявляется равно­мерным помутнением среды, без образования газа, с последующим просветлением среды и осадком. На глюкозно-кровяном агаре образует мелкие росинчатые прозрачные колонии без зоны гемолиза.

Этот микроорганизм не сбражива­ет ни один из углеводов. Обладает интенсивной протеолитической способностью: желатину разжижает, молоко пептонизирует, на мозговой среде вызывает почернение. Индол не образует. Сероводород выделяется в значительном количестве. Продуцирует цитотоксин некротического и летального действия. Патогенен в S-форме.

Таким образом, злокачественный отек — процесс полимикробной этиоло­гии, ассоциация складывается в любом сочетании из названных видов микробов. Бактериологическая диагностика основывается на культурально-морфологических, ферментативных и биологических свойствах каждого. Для ус­тановления патогенности заражают восприимчивых лабораторных животных. Павших животных вскрывают, из органов трупа проводят высевы на питательные среды, выделенную культуру идентифицируют.

Для идентификации возбудителей злокачественного отека используют серо­логическую реакцию нейтрализации токсина специфической сывороткой. С этой целью минимальную смертельную дозу культуры или ее фильтрата смешивают с 0,2 0,5 мл соответствующей типоспецифической сыворотки, выдерживают в тер­мостате 45 минут, вводят внутрибрюшинно (или подкожно) белым мышам. Одно­временно для контроля испытывают культуру или её фильтрат без сыворотки. Вид микроба определяют по выживаемости мышей, получивших смесь культуры с соответствующей специфической сывороткой. Контрольные животные гибнут.