Тема: Возбудитель сибирской язвы

Цель занятия: Освоить правила взятия и пересылки патологического материала для лабораторного исследования на сибирскую язву, а также методы микроско­пического и серологического (РП) исследования патологического материала на сибирскую язву.

Задание:

1. Приготовить мазки-отпечатки из ткани органов трупов мышей

2. Окрасить по Граму

3. Окрасить Михину

4. Просмотреть под микроскопом и зарисовать в тетрадях микро­картину.

5. Приготовить посевы из сердца, печени или селезенки в пробирки с

6. МПБ, МПА, МПЖ.

Материалы и оборудование: Трупы белых мышей, зараженных вакцинным штаммом возбудителя сибирской язвы; стерильные наборы инструментов для вскрытия (ножницы, пинцеты, шпатели); питательные среды в пробир­ках (МПБ, скошенный МПА), стерильные пастеровские пипетки; преципитационныё пробирки в штативах; преципитирующая сибиреязвенная сыво­ротка, нормальная сыворотка (для контроля), стандартный сибиреязвенный антиген; физраствор, воронки для фильтрации, асбестовая вата. Для демон­страции необходимы таблицы по морфологическим и культуральным свой­ствам В. anthracis и биопрепараты.

Классификация:

Отдел – Firmicutes;

Секция – 13, спорообразующие Г “+” палочки

Порядок – Eubacteriales;

Семейство – Bacillaceae;

Род – Bacillus;

Виды – Bacillus anthracis

Возбудитель Bacillus anthracis— вызывает остро протекающую инфекционную болезнь многих видов сельскохозяйствен­ных, диких животных, а также и человека -сибирскую язву. Болезнь характеризуется явлениями септицемии или образованием карбункулов. У свиней характерным признаком является поражение заглоточных лимфоузлов (ангинозная форма). При подозрении на сибирскую яз­ву (вздутие трупа, кровянисто-пенистые истечения из естественных отверстий, не свернувшаяся «лаковая кровь») труп вскрывать нельзя во избежание попадания возбудителя в почву, где он образует спору. Наиболее восприимчивы — крупный рогатый скот, овцы, козы, лошади, олени, верблюды, буйволы; менее восприимчивы - свиньи, нутрии. Маловосприимчивы: собаки, кошки и дикие плотоядные. Источник возбудителя – больные животные. Выделяют возбудителя с калом, мочой, слюной.

Факторами его передачи– трупы животных, контаминированные этим возбудителем, почва, корма, вода, навоз, подстилка, предметы ухода за животными, сырье и продукты животного происхождения. Переносчиками возбудителя могут быть плотоядные животные, птицы, кровососущие насекомые. Сибирская язва относится к почвенной инфекции. Заражение происходит чаще на пастбищах алиментарным путем. Сибирская язва регистрируется чаще всего в летний период, реже зимой при поедании животными инфицированного корма. Отмечается стационарность болезни. В настоящее время сибирская язва протекает в виде спорадических случаев, летальность до 100%.

Патологический материал. Для бактериологического исследования в лабора­торию направляют ухо от трупа, отрезанное с той стороны, на которой труп лежит (или кровь из надреза уха). Ухо предварительно перевязывают лигатурами (шпага­том) у основания в двух местах и между ними отрезают. Место разреза уха прижи­гают нагретым шпателем. Не снимая лигатуры, отрезанное ухо заворачивают в чис­тую марлю (тряпку), пропитанную 3 %-ным раствором борной кислоты, и заверты­вают в целлофан (полиэтиленовую пленку, пергаментную бумагу), помещают в герметически закрытую емкость (коробку, металлический ящик). При взятии крови место надреза предварительно дезинфицируют и после взятия прижигают огнем или раскаленным металлическим предметом. Кровь толстым слоем наносят на 3—4 предметных стекла, высушивают на воздухе. При подозрении в заболевании сибир­ской язвой у свиней (наличие припухлости в области шеи) берут участки отечной соединительной ткани, заглоточные лимфоузлы. При подозрении на сибирскую яз­ву во время вскрытия, последнее прекращают и на бактериологический анализ на­правляют часть селезенки. Диагностируют сибирскую язву на основании результа­тов бактериологического и серологического (РП) исследований.

Рис.13 Бациллы сибирской язвы. Окраска по Граму.

Лабораторная диагностика в первую очередь предусматривает выделение возбудителя. Основная схема лабораторного исследования патологического материала включает: микроскопию окрашенного мазка, посев на питательные среды, заражение лабораторных животных, серологические исследования в РП.

Микроскопия.Из патологического материала готовят мазки, окрашивают по Граму (вегетативная форма), Михину, Романовскому — Гимзе, Ребигеру (капсула) и методом Пешкова, Ауески (споровая форма).

В. anthracis представляет собой круп­ную грамположительную палочку, образующую капсулу и спору. Клетки располагаются одиночно, парами или в виде коротких цепочек. Концы палочек, обращенные друг к другу, резко обруб­лены, свободные концы закруглены. В мазках из культур В. anthracis имеет вид стрептобацилл (длин­ные цепочки из палочек). В материале от свиней форма микроба мо­жет быть нетипичной: короткие, толстые, изогнутые, зернистые палочки со взду­тием посредине или на концах. В мазках из тканей животного сибиреязвенные палочки окружены капсулой, на обычных питательных средах возбудитель капсу­лу не образует. При окраске по Ребигеру капсулы приобретают красно-фиолетовый цвет, бактерии - темно-фиолетовый. Методом Михина, Романовского-Гимза – тело клетки окрашивается в синий цвет, капсула – в бледно-розовый. В культурах и во внешней среде микроб образует спо­ру, которая обычно располагается центрально. При окраске по Ауески: вегетативная часть клетки - синяя, споры – красные. Для спорообразования необходим доступ кислорода, температура в пределах 12-45⁰С.

Бацилла без жгутиков, неподвижна.

Культуральные свойства. Возбудитель к питательным средам не требователен и растет на обычных питательных средах (МПА, МПБ, МПЖ). Аэроб. Оптимум температур – 35-37⁰С. На МПА типичные вирулентные штаммы В. anthracis образу­ют плоские, матовые, серовато-беловатые, шероховатые колонии (R-форма) с затемненным центром, с локонообразными отростками, представляющими сплетения длинных цепочек из палочковидных микроорганизмов. Молодые колонии вязкой консистенции. На сывороточном агаре в присутствии 10-50% углекислоты обнаруживаются гладкие полупрозрачные колонии (S-форма), состоящие из капсульных палочек. В МПБ и других жидких средах сибиреязвенная бацилла (R-форма) через 16-24 ч растет с образованием рыхлого белого, в виде комочка ваты, осадка, среда остается прозрачной, при встряхивании осадок разбивается на мелкие хлопья. Некоторые штаммы могут обусловить легкое помут­нение бульона, возможно образование пристеночного кольца по мениску бульона, пленка не образуется. В МПЖ растет по уколу, но не одинаково интенсивно: ближе к поверхности (больше доступ кислорода) рост обильнее в виде ответвлений от стержня-укола посева. По мере углубления рост ухудшается, образуется «елочка» вершиной вниз; спустя 2-3 дня желатина медленно разжижается в виде воронки.

В жидких сывороточных средах растет интенсивно с образованием обильного хлопьевидного осадка. На кровяном агаре гемолиза не вызывает. В молоке размножается быстро и через 2-4 дня свертывает его с последующей пептонизацией сгустка. Агаровые и бульонные культуры некоторых штаммов интенсивно окрашиваются в коричневый цвет.

Обнаружение в пат. материале и выделение культуры бактерий с характер­ными для возбудителя сибирской язвы морфологическими и культуральными признаками считается достаточным для постановки положительного диагноза на сибирскую язву.

С целью дифференциации и идентификации В. anthracis от сапрофитных бацилл (B.cereus, B.meganterium, B.mycoides, B.subtilis) и в сомнительных случаях у выделенной культуры определяют ряд признаков:

- патогенность;

- капсулообразование;

- окрашивают препа­раты из культуры сибиреязвенной люминесцирующей сывороткой;

- чувствительность к сибиреязвенному бактериофагу;

- гемолитические свойства,

- лецитиназная активность,

- образование фосфатазы.

В отличие от сходных бацилл возбудитель сибирской язвы не подвижнен, не дает гемолиза на кровяном агаре, в организме больного жи­вотного образует капсулу, чувствителен к пенициллину, проявляя феномен «оже­релья», патогенен для белых мышей, кроликов и морских свинок, дает специфичное свечение в МФА, низкая лецитиназная активность, не образует фосфатазу.

1) Для определения чувствительности к пенициллину культуру высевают в чашки Петри на МПА, содержащим 0,5 и 0,05 ЕД пенициллина на 1 мл среды, инкуби­руют в термостате в течение 3 часов при 37-38 °С. Клетки возбудителя приоб­ретают шаровидную форму («ожерелье»), что является следствием чувствитель­ности В. anthracis к пенициллину и представляет начальную стадию его L-трансформации. Псевдобациллы сапрофиты на агаре с пенициллином этого феномена не дают.

2) Проба с сибиреязвенным бактериофагом, чаще методом стекающей капли. Сибиреязвенный бакте­риофаг, взаимодействуя с гомологичной культурой, вызывает ее лизис. С этой целью после засева поверхности скошен­ного МПА исследуемой культурой (или патматериалом) в пробирку вносят каплю фага и ставят ее в термостат вертикально, капля стекает на дно пробирки. При нали­чии В. anthracis на поверхности МПА после инкубирования в термостате будет на­блюдаться рост культуры, за исключением участка, где стекала капля фага — сте­рильная зона (дорожка) – лизабельность фагом. Эта реакция высокоспецифична. При росте других видов микроорганизмов наблюдается сплошной рост культуры, дорожки стекающей капли не будет.

3) Люминесцентную микроскопию проводят прямым или непрямым МФА. Положительным результатом считают контурное свечение бациллярных клеток на четыре и три креста. Ориентировочный метод.

4) Биопробу ставят на белых мышах или морских свинках. Животных заража­ют подкожно суспензией тканей органов или культурой возбудителя. Доза для мышей 0,1—0,2 мл, для морских свинок 0,5—1 мл. Павших животных вскрывают и проводят полное бактериологическое исследование трупов.

Серологическое исследование.Диагностировать сибирскую язву можно также путем обнаружения сибиреяз­венного антигена в исследуемом материале (особенно в несвежем). Обычно ис­пользуют реакцию преципитации (РП) по методу Асколи. Антигеном (преципитиногеном) для РП служит вытяжка (экстракт), полученная из тканей органов (в том числе уха), посту­пивших в лабораторию. Преципитиноген устойчив к гниению и нагреванию. Матери­ал экстрагируют физиологическим раствором, подвергая его кипячению в течение 20 минут, фильтрации через асбестовую вату. Вторым компонентом является - преципитирующая стандартная сибиреязвенная сыворотка со специфическими антителами (преципитинами).

В ветеринарной практике РП имеет большое значение при исследовании кожевенно-мехового сырья на сибирскую язву. В лабораторию доставляют пробы кожсы­рья в виде небольших квадратиков (или кружков), взятых от шкур в местах, вырез ко­торых не снижает товарной ценности их. Эти пробы нанизывают на тонкую проволо­ку (или тонкий упругий жгут) в том порядке, как расположены шкуры на складе. По­ступившие пробы обязательно стерилизуют автоклавированием при 1,5 атм 30 минут. Затем пробы измельчают и берут навески: 1 г от парного, мороженого, пресно-сухого и сухосоленого сырья и 2 г — от мокросоленого. Затем пробы заливают экстраги­рующей жидкостью (физиологический раствор с 0,3 % кристаллического фенола). Пробы сырья от всех видов животных экстрагируют холодным способом в те­чение 16 - 20 часов при комнатной температуре; пробы от свиных шкур кипятят 30 минут. Экстракты фильтруют, предварительно взбалтывая содержимое баночек с пробами, через асбестовую вату до прозрачности.

РП ставят в специаль­ных маленьких пробирках Уленгута или методом диффузии в агаровом геле. В пробирки пастеровской пипеткой наслаивают компоненты в равных объемах – вначале стандартная сыворотка, затем антиген. При положительном результате на границе двух жидкостей почти сразу или в течение 1-2 минут образуется резко ограниченное беловатое кольцо или диск – преципитат.

Контроли РП: 1. Преципитирующая сыворотка: а) со стандартным сибиреязвенным антигеном (результат положительный в течение 1—2 минут), б) с экстрактом из заведомо бла­гополучных боенских кож (результат отрицательный в течение 1 часа), в) с экстра­гирующей жидкостью (результат отрицательный в течение 1 часа).

2. Контроль ас­бестовой ваты на нейтральность (при поступлении каждой новой партии асбестовой ваты). Учет результатов РП проводят через 10—15 минут пресно-сухое (одиночных проб); через 30 минут — пресно-сухое (сдвоенных проб), сухосоленое (одиночных); через 60 минут — сухосоленое (сдвоенное), мокросоленое.

Диагноз на сибирскую язву считают установленным при получении поло­жительного результата хотя бы в одном из следующих случаев:

ü выделении из исследуемого материала культуры бактерий, патогенной для ла­бораторных животных, и со свойствами, характерными для возбудителя си­бирской язвы;

ü гибели зараженных животных и обнаружении в их организме возбудителя си­бирской язвы при отрицательных высевах из исходного исследуемого мате­риала на питательные среды;

ü положительном результате иммунофлуоресценции, в сочетании с обнаружением капсульных микроорганизмов, типичных для возбудителя сибирской язвы в патологическом материале;

ü положительном результате РП;

ü лизабельность сибиреязвенным фагом;

ü феномен «жемчужного ожерелья»

Диагностика: учитывают эпизоотические, клинические, патологоанатомические данные, результаты бактериологического и серологического (реакция преципитации) исследований. У свиней используют аллергический метод диагностики.

Контрольные вопросы:

1. Правила взятия патологического материала.

2. Методы бактериологической диагностики сибирской язвы.

3. Морфологические, тинкториальные и культуральные свойства В. anthracis.

4. Дифференцирование В. anthracis от сапрофитных спорообразующих аэробов.

5. Идентификация при помощи сибиреязвенного бактериофага.

6. Феномен «ожерелья».

7. Серологические методы обнаружения сибиреязвенного антигена в исследуемом материале.