Тема: Возбудители пастереллёза и туляремии

Цепь занятия:Освоить правила отбора и пересылки патологического материала для бактериологического исследования на пастереллез. Изучить морфологиче­ские, культуральные и биохимические свойства возбудителя пастереллеза. Озна­комиться с биологическими препаратами, применяемыми для специфической профилактики и лечения пастереллеза, а также с методами микробиологической диагностики туляремии.

Задание:

1. Приготовить мазки из культуры P. multocida на МПА и МПБ;

2. Окрасить препараты по Граму, синькой Леффлера, микроскопировать и зари­совать в тетради;

3. Сделать препарат "раздавленная капля" с P.Multocida;

4. Вскрыть трупы мышей зараженных P. Multocida, произвести посевы на МПА и МПБ из крови, сердца, селезенки, печени, приготовить препараты из них и ок­расить по Граму

5. Окрасить и просмотреть под микроскопом готовые препараты с F. tularensis.

Материалы и оборудование:Культуры P. multocida на МПА, МПБ, 0,3 % МПА в пробирках, на МПА и кровяном агаре в чашках Петри, в МПБ с 0,1 % KN03; тру­пы белых мышей, зараженных P. multocida; культуры P. multocida на средах Гисса с глюкозой, лактозой, сахарозой, сорбитом; реактивы Гисса и Эрлиха; по­кровные стекла, стерильные пастеровские пипетки, стерильные питательные сре­ды: МПБ и скошенный МПА в пробирках; биопрепараты — вакцины и сыворот­ки против пастереллеза; туляремийный антиген для РА и позитивная сыворотка; готовые фиксированные мазки F. tularensis (туляремийныи антиген для РА).

Классификация:

Отдел – Gracilicutes;

Секция – 5, грамотрицательные факультативные анаэробы.

Порядок – Eubacteriales;

Семейство – Pasteurellaceae/ Brucellaceae;

Род – Pasteurella;

Виды – Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica.

Возбудитель пастереллёза (геморрагическая септицемия)— Pasteurella multocida. Пастереллезом болеют многие виды сельскохо­зяйственных животных. Болезнь характеризуется явлениями септицемии и воспа­лительно-геморрагическими процессами во внутренних органах, на серозных и слизистых оболочках. Наличие множественных точечных геморрагий (кровоизлияний) – есть характерный патологоанатомический признак. Лабораторная диагностика основывается на выделении культуры возбудителя и изучении ее свойств.

Патологический материал.Для бактериологического исследования от крупных животных в лабо­раторию направляют печень, селезенку, почку, лимфоузлы, кровь из сердца, трубчатую кость. Трупы мелких животных – целиком. В летнее время и при пересылке на дальнее расстояние органы помещают в 30 %-ный водный раствор глицерина, а трубчатую кость заворачи­вают в марлю или вату, пропитанные 5—10 %-ным раствором формалина.

Морфология и тинкториальные свойства P.multocida. Препараты-отпечатки высушивают, фиксируют и окрашивают часть по Граму, часть по Романовскому-Гимза, или синькой Лёффлера, разведенным фуксином. В мазках-отпечатках из органов и крови, окрашенных по Граму, пастереллы выявляется в виде грамотрицательных мелких коротких палочковидных бактерий с закругленными концами (0,3x1.5 мкм), овоидной формы. Споры не образует. Многие вирулентные свежевыделенные штаммы формируют капсулу, которая при окраске специальными методами легко выявляется. P. multocida не обладает подвижностью. При окраске синькой Леффлера или по Романовскому-Гимза пастереллы имеют вид биполяров (интенсивно окрашены концевые участки бактериальной клетки, центральная часть окрашена очень слабо). В мазках из культур пастереллы представляют собой коккобактерии или короткие палочки, расположенные одиночно, попарно, иногда в виде коротких цепочек.

Культуральные свойства.P. multocida — аэроб, факультативный анаэроб, темпе­ратурный оптимум +37—38 °С, оптимальный рН 7,2—7,4. Посевы из исследуе­мого материала производят на МПА, МПБ, но лучше на обогащенные пи­тательные среды - кровяной МПА, сывороточный МПА или МПБ, бульон Хоттингера или Мартена. Посевы инку­бируют 24—48 часов. При отсутствии роста возбудителя на плотных средах по­севы целесообразно выдерживать до 4—5 суток. На МПА пастереллы растут в виде мелких, выпуклых, прозрачных, круглой формы колоний, которые флуорес­цируют или создают радужность в косопроходящем свете (S-форма), что связано с капсулообразованием. Иногда возбудитель формирует бо­лее крупные слизистые (М-форма) или шероховатые колонии (R-форма). Гемоли­тической активностью P. multocida не обладает. В МПБ пастереллы растут с рав­номерным помутнением среды и образованием на дне пробирки слизистого осад­ка, поднимающегося при встряхивании в виде «косички» (S-форма); мукоидные штаммы растут более интенсивно и дают массовый слизистый осадок, диссоции­рованные пастереллы (R-форма) не вызывают помутнения среды, а на дне про­бирки образуется мелкозернистый или хлопьевидный осадок. На МПЖ возбудитель растет вначале отдельными колониями, затем в виде белого стержня без отростков.

Ферментативные свойства.Производят посев культуры на среды Гисса с углеводами. Обычно P. multocida ферментирует глюкозу, сахарозу, маннит, сорбит с образованием кислоты без газа; не ферментирует лактозу и дульцит. Редуцирует нитраты, является продуцентом индола, не образует уреазу, не обладает гемолитической активностью, не разжи­жает желатину, не свертывает и не пептонизирует молоко. Редукцию нитратов определяют путем выращивания культуры в МПБ с 0,1 % KN0₃ в течение 1—2 суток, затем в пробирку с культурой пастерелл добавляют 2—3 капли реактива Гисса. В положительном случае появляется фиолетово-красное окрашивание среды. Образование индола определяют общепринятыми способами с использо­ванием 3—4-суточной культуры в бульоне Хоттингера или Мартена. Каталазоположительные.

Биопроба.Заражение лабораторных животных проводят с целью выделения чистой культуры возбудителя или испытания ее вирулентности. Исследуемым материалом от крупного рогатого скота, свиней, овец заражают белых мышей и кроликов, от птиц — голубей, кур, уток. Голубям суспензию материала вводят внутримышечно в дозе 0,3 мл, белым мышам и кроликам подкожно в дозе 0,2 мл первым и 0,5 мл — вторым. Кроликов перед заражением исследуют на пастереллоносительство. С этой целью кроликам вводят по 2 капли 0,5 %-ного водного раствора бриллиантовой зелени в течение трех дней до заражения. Появление гнойного истечения из носовой полости свидетельствует о пастереллоносительстве. Носителей исключают из опыта. При наличии в патологическом материале пастерелл перечисленные виды животных погибают в течение 18—36 часов. При испытании вирулентности вы­деленных культур пастерелл проводят подкожное заражение бульонной культу­рой в тех же дозах голубей, белых мышей или кроликов.

Положительный бактериологический диагноз на пастереллез ставят при выде­лении из патологического материала культур грамотрицательных, капсулообразующих, неподвижных палочковидных бактерий, редуцирующих нитраты, образующих индол, обычно расщепляющих глюкозу, сахарозу, сорбит и маннит, не обладающих гемолитической активностью и вирулентных для лабораторных животных.

Туляремия – природно-очаговая острая инфекционная болезнь животных и человека, характеризующуюся лихорадкой, параличами у молодняка, увеличением лимфатических сосудов и абортами.

Классификация:

Отдел – Gracilicutes;

Секция – 4, грамотрицательные аэробные палочки и кокки.

Порядок – Eubacteriales;

Семейство – Brucellaceae;

Род – Francisella;

Вид – Francisella tularensis.

Возбудитель туляремии — Francisella tularensis.У домашних животных чаще протекает в септической форме и характеризуется увеличением подкожных лим­фатических узлов, нервными явлениями; у крупного рогатого скота может про­являться маститами, у лошадей — абортами. В естественных условиях к возбуди­телю туляремии восприимчивы грызуны (около 40 видов), насекомоядные, реп­тилии, амфибии и др. Из сельскохозяйственных животных наиболее вос­приимчивы ягнята, поросята, цыплята.

Патологический материал.При жизни животного исследуют пунктат из увеличенных лимфатических узлов, от абортированного плода или плод целиком, мочу, фекалии; после гибели животного — печень, почки, селезенку, уве­личенные лимфоузлы от крупных животных, трупы грызунов и других мелких животных. При необходимости патматериал можно консервировать в растворе глицерина или в смеси стерильного вазелинового масла с парафином (25 мл мас­ла и 2,5 мл парафина).

Все работы по выделению и идентификации возбудителя туляремии можно проводить только в лабораториях со специальным режимом для особо опасных инфекций.

Микроскопия.Мазки-отпечатки, приготовленные из патологического мате­риала, окрашивают по Граму и по Романовскому — Гимзе в течение 1—1,5 часов или разведенным фуксином. Необходимо помнить, что обнаружить возбудителя туляремии можно только при обильном обсеменении патологического материала. F. tularensis — мелкая грамотрицательная коккоподобная бактерия в мазках из культуры, и тонкая палочка — в препаратах из органов. Величина 0,03-0,7 х 0,2-0,4 мкм. Споры не образует, неподвижная. В организме животного образует нежную капсулу (не всегда). По Романовскому — Гимзе окрашивается в розово-голубой цвет, часто биполярно.

Культивирование.F. tularensis — аэроб, температурный оптимум +37—38 °С, оптимальный рН 6,7-7,4. Культуры возбудителя выделяют посевом на спе­циальные питательные среды: свернутую желточную среду Мак-Коя, шоколад­ный агар Френсиса, кровяную среду Емельяновой.

Среда Мак-Коя: на 60 частей куриных желтков добавляют 40 частей сте­рильного физиологического раствора (дистиллированную воду для физраствора подщелачивают до рН 7,6—7,2). Для свертывания среды ее выдерживают при +80 °С 1 часов. Среда Френсиса: к МПА с 1 % пептона и 0,5 % NaCI (рН 7,3) добав­ляют 0,1 % цистина и 1 % глюкозы, кипятят несколько минут, затем охлаждают до +50 °С и добавляют 10 % дефибринированной, стерильно полученной крови кролика. Среда Емельяновой: в рыбно-дрожжевой агар вносят 0,1 % цистина и 1 % глюкозы. Затем агар расплавляют, охлаждают до +45°С, к нему добавляют 10 % дефибринированной крови, разливают по чашкам Петри или в пробирки. Дан­ная среда наиболее чувствительна.

Методом прямых посевов культуры возбудителя туляремии можно выде­лить только от грызунов (мыши, крысы и др.). Из организма сельскохозяйственных животных и пушных зверей возбудителя выделяют биологическим методом путем 2—3 «слепых» пассажей через высокочувствительных животных (белых мышей, морских свинок). Посев на твердые среды проводят путем прикладыва­ния к поверхности среды небольшого кусочка ткани, взятого из глубины иссле­дуемого материала, тканевой сок втирают в поверхность среды. На средах с кро­вью через 1—2 дня культивирования появляются мелкие колонии беловатого цвета с голубоватым оттенком, круглые, выпуклые с ровна, краями, гладкие, блестящие. На жидких средах F. tularensis растет плохо. При культивировании следует учитывать, что типичной формой колонии является S-форма, об­ладающая Vi- и О-антигенами, вирулентная и иммуногеная.

R-форма F. tularen­sis содержит лишь 0-антиген и авирулентна.

Биохимические свойствавыражены слабо, но на специальных питательных средах с пониженным содержанием белка F. tularensis ферментирует с образова­нием кислоты без газа глюкозу, мальтозу, маннозу, глицерин, декстрин. Обладает протеолитическими свойствами, расщепляет белки с образованием сероводорода. Индол не образует.

Биопробаоснована на заражении белых мышей и морских свинок суспен­зией, растертых тканей патологического материала подкожно и внутрибрюшинно (в дозе 0,5 мл). Белые мыши погибают на 3—4-й день (иногда 8—12-й), морские свинки — через 4—5 дней. Если в материале мало клеток возбудителя, гибель животных возможна на 8—15-й день. При вскрытии трупов отмечают некротиче­ские очаги в легких, селезенке, печени, лимфатических узлах; из внутренних ор­ганов делают посевы с целью выделения культуры возбудителя, которую иден­тифицируют в пробирочной РА. В качестве антигена используют 2-суточную культуру, выращенную на среде Мак-Коя. Микробную массу снимают петлей (смывать нельзя), суспендируют в физиологическом растворе, доводят концен­трацию до 5 млрд микробных клеток в 1 мл по стандарту для туляремийного микроба. Микробную взвесь в дозе 0,5 мл вносят в пробирки со специфической сывороткой в разных разведениях, не менее чем до 1:20000, встряхивают, поме­щают на 2 часа в термостат, затем оставляют при комнатной температуре на 20— 22 часа. Положительным результатом считают четко выраженную агглютинацию при полной прозрачности жидкости над агглютинатом. Для быстрого обнаружения возбудителя в органах и тканях исследуемого животного применяют РСК или РП. В качестве антигена используют экстракт из тканей поступившего в лабораторию трупа животного (грызуны, пушные звери).

Контрольные вопросы:

1. Особенности морфологии и тинкториальных свойств пастерелл.

2. Культуральные и ферментативные свойства пастерелл.

3. Значение биопробы в диагностике пастереллеза.

4. Схема бактериологического исследования на пастереллез.

5. Биопрепараты: вакцины, лечебно-профилактические сыворотки.

6. Морфология, тннкториальные, культуральные свойства возбудителя туляремии.

7. Патогенные свойства возбудителя туляремии

8. Питательные среды, применяемые для культивирования F. Tularensis. Культуральные и биохимические свойства возбудителя туляремии.

9. Бактериологическая и серологическая диагностика туляремии.