Тема: Возбудитель листериоза

Цель занятия: Ознакомить студентов с правилами взятия, упаковки и пересылки патологического материала. Усвоить методы бактериологических и серологиче­ских исследований для диагностики листериоза.

Задание:

1. Произвести вскрытие трупов белых мышей и сделать посевы на МПА, МПБ из крови

сердца, печени или селезёнки

2. Сделать препараты-отпечатки из органов и препараты из бульонной культуры для

определения их подвижности, окраска мазков для микроскопирования.

3. Изучить культуральные и биохимические свойства возбудителя.

4. Поставить РА на стекле с поливалентной листериозной сывороткой.

Материалы и оборудование. Трупы белых мышей, павших после заражения вак­цинным штаммом листерий; наборы стерильных инструментов для вскрытия, пастеровские пипетки; 12-часовая бульонная культура вакцинного штамма лис­терий, выращенная при комнатной температуре; поливалентная листериозная сыворотка, флуоресцирующая листериозная сыворотка, чашки Петри с филь­тровальной бумагой.

Для демонстрации: суточная культура листерий, выращен­ная в средах с углеводами — глюкозой, мальтозой, рамнозой, салицином, трегалозой, дульцитом, раффинозой; биопрепараты.

Классификация:

Отдел – Firmicutes;

Секция – 14, неспорообразуюшие грамположительные палочки.

Порядок – Eubacteriales;

Семейство – Corynebacteriaceae;

Род – Listeria;

Виды – Listeria monocytogenes, L. ivanovii, L. innocua, L. seeligeri, L. grayi, L. murrayi.

Возбудитель листериоза сельскохозяйственных животных - Listeria monocytogenes.

Листериоз – инфекционная болезнь животных многих видов и человека. Характеризуется поражением центральной нервной системы (менингоэнцефалиты), половых органов (аборты), молочной железы (маститы) и явлениями септицемии. Болеют многие виды сельскохозяйственных и диких животных, грызунов, птиц.

Патологический материал. В лабораторию следует направлять трупы мел­ких животных (грызунов), голову павшего животного (для исследования мозга), паренхиматозные органы (печень, селезенка, почка и пораженные участки лег­ких), абортированный плод, плодные оболочки, истечения из родовых путей, мо­локо из пораженной доли вымени. От больных подозреваемых в заражении жи­вотных также берут кровь для серологических исследований.

Рис.8 Жгутики у листерии. Рис.9 Окраска по Граму (эл. микроскопия).

Микроскопия. Мазки-отпечатки из органов, включая головной мозг, окрашивают по Граму и методом флуоресцирующих антител. В препаратах, окрашенных по Граму, листерии имеют вид грамположительных палочек, могут встречаться поли­морфные клетки размером 0,5x2 мкм. Спор и капсул не образуют. Подвижны (6-12ч.культуры).

Обнаружение при люминесцентной микроскопии впатологическом материалеморфологически типичных для листерий бактерий, светящихся на 3—4 креста, позволяет поставить положительный люминесцентно-серологический диагноз.

Рис.10 Флюоресценция листерий в люминесцентном микроскопе.

При сомнительном или отрицательном ре­зультатах люминесцентной микроскопии проводят исследование материала с це­лью выделения культуры возбудителя.

Культивирование и культуральные свойства. L. monocytogenes — аэроб (факультативный анаэроб). Температурный оптимум +37 °С. Наиболее интенсивно бактерии развиваются при температуре 25-37ºС, но способны размножаться и при низких температурах: от 2°С до 4°С в почве, воде, на растениях, в органах трупов. В различных пищевых продуктах (молоко, мясо и др.) размножаются при температуре бытового холодильника. При этих условиях культивирования листерий дают хороший рост, хотя и замедленный в сравнении с выращиванием при 37°С. Верхняя температурная граница роста – 42-44°С.

При температуре 70°С погибают через 20-30 минут, при 100°С - через 3-5 минут; инактивируются растворами формалина (0,5%-1%), фенола (5%), хлорной извести (100 мг активного хлора в 1 л).

Listeria monocytogenes растет на многих питательных средах, основу которых составляет мясо-пептонный бульон, бульон Хоттингера, мясо-пептонный агар, картофельный агар, мозговой агар с добавлением глюкозы (0,5-1%), глицерина (2-3%), дрожжевого экстракта (10%), сыворотки крови (10%), сердечно-мозговой бульон, МПА с теллуритом калия и сывороткой крови, а также на некоторых синтетических средах. В настоящее время широко применяют новые среды для селективного обогащения и выделения листерий – Fraser бульон, Half - Fraser бульон, Oxford -, Palcam - агар и др.

Из патологического материала делают обильные посевы на перечисленные среды. При исследовании абортированных плодов посевы производят из содержимого желудка и внутренних органов. Истече­ния из половых органов и молоко засевают на печеночный агар с добавлением 1 % глюкозы и 2—3 % глицерина из МПБ с 10 % NaCl.

Рис.11 Рост листерий на Palcam – агаре

В последнем случае после по­явления роста из МПБ делают высев на плотные питательные среды. Наблюдение за посевами продолжают в течение 2 недель. Параллельно часть исследуемого мате­риала рекомендуется выдерживать в холодильнике (+ 4°С) до 30 дней, поскольку при этой температуре происходят размножение и накопление листерий. При отри­цательном результате первичного посева из сохраняемого материала каждые 10 дней производят повторные высевы на питательные среды. Данный методический прием позволяет увеличить количество положительных бактериологических нахо­док, но исследование занимает длительный срок. Возбудитель листериоза в МПБ вызывает легкое помутнение бульона и формирует мелкие росинчатые колонии на МПА. На кровяном агаре растет, образуя зону α-гемолиза. Просмотр посевов на твердых средах лучше проводить в проходящем свете с осветителем ОИ-19 с голубым светофильтром. При этом ко­лонии листерий, в отличие от колоний других микроорганизмов, имеют голубую окраску с зеленоватым оттенком и мелкозернистую структуру. На средах типа PALCAM-агарачерез 24ч. инкубирования листерии формируют мелкие, серовато-зеленые или оливково-зеленые колонии с черным ореолом, диаметром 0,5-1,0 мм, иногда с черным центром. Через 48ч. колонии диаметром 1,0-2,0 мм приобретают зеленую окраску с углубленными центрами, окруженными черным ореолом. Кокковая микрофлора (бактерии родов Staphylococcus, Enterococcus) образуют желтые колонии за счет ферментации маннита.

Из культур готовят мазки, окрашивают по Граму или флуоресцирующими сыворотками в прямом и непрямом вариантах. В мазках, окрашенных по Граму, и положительных случаях обнаруживают небольшие грамположительные палочко­видные бактерии (0,5x1—2 мкм) с закругленными концами, располагающиеся одиночно, в виде римской пятерки, коротких цепочек или параллельно. Возбуди­тель спор и капсул не образует, подвижен. Подвижностью обладают листерий в молодой (6-12-ч.) бульонной культуре, выращенной при пониженной температуре (+20-22 °С).

Ферментативные свойстваизучают у культур, имеющих типичную для листерий морфологию. Листерии относятся к группе сравнительно малоактивных в ферментативном отношении бактерий. Не образуют индол, аммиак, сероводород, не гидролизуют мочевину. Способны разлагать с образованием кислоты без газа глюкозу, салицин, рамнозу, мальтозу, при отсутствии разложения дульцита, инозита, инулина и арабинозы. Каталазную активность определяют добавлением свежеприго­товленной 5 %-ной перекиси водорода к суточной бульонной культуре в равном объеме или нескольких капель в агаровую культуру. Образование пузырьков газа («пены») свидетельствует о наличии у культуры фермента каталазы, что харак­терно для листерий. Все виды Listeria обладают гемолитической и лецитиназной активностью. Для культур L. monocytogenes характерна вокруг места укола узкая зона гемолиза. Для окончательной идентификации патогенных листерий рекомендуется использовать КАМП-тест (метод Christie – Atkins – Munch – Peterson), ферментацию углеводов и определение активности на средах с углем и без него.

С целью дифференциации возбудителя листериоза от возбудителя рожи свиней используют также индикаторные среды с красителями. Метод основан на редукции и оксидации красок в средах под влиянием листерий, растущих на дан­ных средах. Листерий обесцвечивают среду с лакмусом, нейтральротом в смеси с метиленовой синькой через 3—6 часов. Возбудитель рожи свиней не обес­цвечивает сред с красителями.

Серологическую идентификацию проводят в пластинчатой РА на стекле. Для этой цели первоначально используют поливалентную листериозную сыво­ротку, агглютинирующую все сероварианты листерий. После идентификации на уровне вида ставят РА с серогрупповыми сыворотками, позволяющими отнести выделенную культуру листерий к определенному серотипу (серогруппе). В каче­стве антигена для пластинчатой РА с поливалентной сывороткой используют 24—30-часовую агаровую культуру, выращенную при +18—26 °С. При опреде­лении серотипа применяют в качестве антигена +18—24-часовую агаровую куль­туру, выращенную при +37 °С. Пластинчатую РА ставят по общепринятой мето­дике, учет результатов осуществляют в течение 3 минут. Появление хлопьев в капле смеси антиген — сыворотка и отсутствие их в контроле (физраствор с ан­тигеном) оценивают как положительный результат РА.

Биопроба. Суспензией из органов и тканей заражают подкожно или внутрибрюшинно в дозе 0,3—0,5 мл белых мышей массой 18 г или особо чувстви­тельных 5—6-дневных мышат. Мышата погибают в положительных случаях че­рез 18— 36 часов. За животными массой 16—18 г наблюдают в течение 14 суток. Из внутренних органов павших животных делают посевы на питательные среды и мазки-отпечатки.

Для дифференциации возбудителя листериоза от возбудителя рожи свиней прибегают к специальным тестам определения патогенности исследуемой культуры в виде конъюнктивальной и кожной пробы. Конъюнктивальную пробу ставят путем нанесения исследуемой суточной культуры на конъюнктиву глаза морской свинки. Листерии через 2—4 дня вызывают развитие гнойного конъюнктивита (и кератоконъюнктивита). Кожную пробу ставят введением 0,3— 0,5 мл суточной бульонной культуры внутрикожнно в область бока кролику или морской свинке. Листерии через 1—2 суток вызывают некроз кожи.

Серологическая диагностика. Используют РА и РСК. Результат РА призна­ется положительным, если реакция оценивается не менее чем на два креста в раз­ведении сыворотки: для овец, коз и свиней — 1:200, для лошадей и крупного ро­гатого скота — 1:400, для кроликов — 1 : 50. Сомнительный результат — РА не менее чем два креста в разведении сыворотки овец, коз, свиней — 1:100, лошадей и крупного рогатого скота — 1 : 200, В РСК сыворотки исследуют в разведении 1:10. Положительный результат — при оценке реакции в четыре креста и три креста (+++), сомнительный — при оценке ++ и +. От животных, давших сомни­тельный результат РСК, полагается повторно исследовать пробы крови через 2—3 недели. Серологическая диагностика является вспомогательной. Основное зна­чение имеют данные бактериологического исследования.

Положительный бактериологический диагноз на листериоз ставят при ус­ловии выделения грамположительной полиморфной, подвижной палочковидной бактерии, обладающей каталазной активностью, расщепляющей с образованием кислоты без газа глюкозу, рамнозу, мальтозу, салицин, дающей положительную конъюнктивальную или внутрикожную пробу и реагирующей в РА с листериозными сыворотками. Как вспомогательный метод используют идентификацию листерий с помощью листериозного бактериофага L 2А и L4A.

Профилактика листериоза включает борьбу с заболеванием среди домашних животных, дератизацию. Употребление непастеризованного молока и загрязнённой воды должно быть исключено.