Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам

Для успешного проведения лечения антибиотиками, особенно в случаях хронической инфекции, необходимо предварительно опреде­лить степень чувствительности к антибиотикам микробов, вызвавших заболевание. При определении чувствительности желательно иметь чистые культуры возбудителя и лишь при необходимости срочного получения ответа используют смешанные культуры, содержащие всю микрофлору, имевшуюся в исследуемом материале.

Наиболее прост и доступен метод определения чувствительно­сти с помощью дисков, пропитанных антибиотиками. В стерильные чашки Петри, расположенные на горизонтальной поверхности, раз­ливают по 15 мл плотной питательной среды (чаще всего 2% агар на переваре Хоттингера, содержащий 0,11—0,13% аминного азота). На поверхность застывшего и слегка подсушенного агара наливают 1 мл суспензии суточной культуры микроба-возбудителя или, если чистая культура не выделена, взятого для исследования патологи­ческого материала (гной, экссудат и т. п.), слегка разведенного изо­тоническим раствором хлорида натрия. Бактериальную взвесь равно­мерно распределяют по поверхности агара, а ее избыток удаляют пастеровской пипеткой. На поверхности засеянного агара пинцетом раскладывают диски с антибиотиками — по 5—6 дисков на каждую чашку на расстоянии 25 мм от центра чашки. Чашки выдерживают при 37°С 16—18 ч, после чего учитывают результаты опыта путем измерения зон задержки роста микробов вокруг дисков, включая диаметр самого диска. Размер зон зависит от степени чув­ствительности возбудителя к данному антибиотику. При зоне диа­метром до 10 мм штамм расценивается как устойчивый, 11–15 мм — как малочувствительный, 15–25 мм — как чувствительный. Зоны, превышающие 25 мм, свидетельствуют о высокой чувстви­тельности микроорганизма к данному антибиотику. Однако этот метод нельзя считать количественным.

Более точные результаты можно получить, применяя метод се­рийных разведений в жидкой среде. Бульон Хоттингера (или другую среду, пригодную для роста данного микроорганизма) разливают по 2 мл в пробирки, расставленные в штативы по 10 в каждом ряду. Готовят раствор антибиотика, содержащий 100 ЕД в 1 мл, и добавляют 2 мл этого раствора в первую пробирку. После тща­тельного перемешивания новой стерильной мерной пипеткой пере­носят 2 мл из этой пробирки в следующую и т. д. до девятой про­бирки, из которой 2 мл выливают. Десятая пробирка, не содержа­щая антибиотика, служит контролем роста культуры. Для поста­новки этого опыта вместо стандартов антибиотиков можно с успехом использовать имеющиеся в продаже препараты, на этикет­ке которых указано количество единиц во флаконе. Например, если флакон содержит 500000 ЕД пенициллина, то, добавив в него 10 мл дистиллированной воды, получают раствор, содержащий в 1 мл 50000 ЕД, при дальнейшем разведении в 100 раз получают раствор с концентрацией пенициллина 500 ЕД/мл. Для получения требуемой концентрации 100 ЕД/мл нужно развести этот раствор еще в 5 раз; это разведение делают при помощи бульона и 2 мл полученного раствора вносят в первую пробирку. Таким образом, в первой пробирке концентрация пенициллина 50 ЕД/мл, во вто­рой — 25 ЕД/мл и т. д. Если на этикетке препарата дозировка указана в весовых единицах, следует иметь в виду, что для большей части антибиотиков 1 г активного вещества соответствует 1 000 000 ЕД. Из этого расчета и следует разводить антибиотик.

Если порошок антибиотика расфасован не мерно, и на этикет­ке указано количество единиц активности в 1 мг, необходимо к точной навеске препарата (20—25 мг), сделанной на аналитических весах, добавить равный объем растворителя, т. е. получить раствор мг/мл, в 1 мл которого содержится столько единиц, сколько их было указано на этикетке. Из этого основного раствора делают дальнейшие разведения по указанной выше схеме. Суточную ага­ровую культуру испытуемого микроба смывают изотоническим раствором хлорида натрия и, определив густоту взвеси по стандарту мутности, разводят до густоты 10000 микробов в 1 мл. Полученную взвесь по 0,2 мл вносят во все пробирки ряда, начиная с контроль­ной. Таким образом, во всех пробирках содержится в 1 мл 1000 микроорганизмов. Результаты опыта учитывают после инкуба­ции при 37°С в течение 18—20 ч. Последняя пробирка с прозрач­ным бульоном при наличии густого роста в контроле определяет минимальную, подавляющую рост данного микроорганизма концен­трацию антибиотика.

Для определения чувствительности микробов к сульфаниламидам может быть применен любой из указанных методов, причем во внимание принимается только степень разведения навески пре­парата. Общую чувствительность к сульфаниламидам, как и к анти­биотикам, можно определить методом канавки. На агаре в чашке Петри по ее диаметру прорезают канавку, в которую вносят опре­деленное разведение изучаемого препарата. Перпендикулярно к канавке засевают штрихом изучаемые культуры микроорганизмов. После инкубации при 37°С 18—20 ч отмечают наличие участков задержки роста микроорганизмов, если последние чувствительны к данному препарату.

Выделение и практическое использование веществ антибиотиче­ской природы основано на взаимоотношениях между микроорга­низмами разных видов.

В настоящее время обнаружены также и антимикробные ве­щества, действующие внутри одного вида, что и отличает их от антибиотиков.

Лабораторные животные

В диагностической работе бактериологических лаборато­рий часто приходится прибегать к заражению так называемых лабо­раторных, или опытных, животных. Чаще всего в повседневной практике применяют для этой цели мелких, наиболее дешевых, животных: белых мышей и крыс, морских свинок, кроликов, а из птиц—голубей и кур. Реже используют собак и кошек, еще реже—различные виды сель­скохозяйственных животных. Цель биологических методов исследования заключается в определении патогенности или степени вирулентности иссле­дуемого материала, выделении из материала чистых культур микробов, отделении патогенных микроорганизмов из смеси с сапрофитными видами и т. д. Широкое применение находят лабораторные животные и в серологической практике: морские свинки—для получения комплемента, кролики (овцы, телята)—при изготовлении различных агглютинирующих сывороток, гемолизина, эритроцитов и т. п. Для изготовления специальных питатель­ных сред от животных получают кровь, сыворотку, различные органы, ткани и т. д. Кроме того, лабораторные животные широко используются при определении качеств биологических и химиотерапевтических препаратов, а также научно-экспериментальной работе. Лабораторные животные служат так­же для диагностики некоторых инфекционных заболеваний, моделирования экспериментальных острых и хронических ин­фекционных процессов, установления вирулентности и токсигенности изучаемых штаммов микробов, определения актив­ности приготовленных вакцин и исследования их на безвред­ность.

Бактериологические лаборатории для повседневной работы обычно разводят лабораторных животных в специально организованных для этой цели питомниках. Это дает возможность всегда получать в достаточном количестве проверенный и безупречного качества подопытный материал. Если животные не разводятся, а только содержатся в лаборатории, то помещения для них носят название – виварий. Новые партии животных закупаются в питомниках. Условия содержания и кормления в данных подразделения практически аналогичны, поэтому в ниже приведенном материале не будет дифференциации между указанными структурами лаборатории.