Окраска жгутиков серебрением – модификация по Морозову

Реактивы: I
40% формалина (продажного)	1 мл
Дистиллированной воды	100 мл
II
Танина	5 г
Дистиллированной воды
Карболовой кислоты (расплавленной)	1 мл

(Клемпарская предлагает применять, во избежание осадков, протраву в виде 2,5—3% раствора танина.)

Раствор аммиачного серебра (III) готовят по следующей методике: 4 г азотнокислого серебра растворяют в 80 мл дистиллированной воды; затем к нему по каплям добавляют крепкий (25%) аммиак, пока образующийся темно-коричневый, а затем буро-черный осадок не растворится и останется лишь легкая опалесценция. Раствор очень стоек. Хранить в темной склянке с притертой пробкой (защищать от пыли!). Перед окраской реактив разбавляется 1 : 10 дистиллированной водой.

Приготовление бактериальной взвеси. Как правило, жгутики в старых культурах теряются. Иногда необходимы частые систематические пересевы в течение долгого времени на жидкие среды (ежедневные пересевы на свежие среды), пока подвижность микробов не восстановится. Хорошей средой для пересевов является также обыкновенный или кровяной агар, свежий, с влажной поверхностью.

На границе с конденсационной водой осторожно захватывают петлей немного бактериальной массы, переносят ее в пробирку, где налито 0,1—0,2 мл 1% формалина (реактив I), легкими движениями петли распределяют микробные тела в жидкости. До окраски приготовленную эмульсию держат при 37° в течение 2 часов и более (сохраняется годами).

Приготовление стекол. Рекомендуют готовить препарат только на новых, еще не бывших в употреблении, безукоризненно чистых предметных стеклах. Стекла обрабатывают (для очистки) концентрированной соляной кислотой в течение 15 минут; затем кислоту сливают, остатки ее нейтрализуют крепким аммиаком, стекла промывают дистиллированной водой и переносят в чистый винный спирт. Вынутые из спирта (пинцетом!) стекла тщательно протирают мягкой чистой тряпочкой. В чашечку или бюксу, где налито 3—4 мл дистиллированной воды, очень тонкой пипеткой вносят 1 каплю формалиновой бак­териальной взвеси. Отсюда маленькой петлей наносят 5—6 отдельных капель взвеси на центральную часть предметного стекла, не касаясь петлей его поверхности и не размазывая капли. Когда капли высохнут на воздухе, приступают к их окраске.

Техника окраски

1) на препарат (пинцет Корнэ!) наливают протраву (реактив II) и в течение 1—2 минут подогревают до появления паров;

2) тщательно смывают протраву дистиллированной водой (удалению протравы способствуют, протирая стекло вокруг мазка кусочком фильтровальной бумаги);

3) обрабатывают препарат в течение 2—2,5 минут раствором серебра (реактив III) при легком подогревании, пока на препарате не станут видны весьма слабо окрашенные в коричневый цвет округлые пятна (рассматривать белом фоне или при проходящем свете!). Тщательно промывают мазок дистиллированной водой и высушивают на воздухе.

Микроскопическая картина: тела бактерий—угольно-черного цвета, жгутики—в виде тончайших волнообразно извитых нитей коричневого или янтарно-черного цвета на прозрачном или желтоватом гомогенном фоне.

Если жгутики не окрасились, удаляют масло с препарата ксилолом и вторично повторяют процедуру окраски, так как жгутики обнаруживаются только при особенно интенсивной окраске.

В препарате могут быть осадки или грязный фон вследствие переноса на стекло частиц агара, конденсационной воды или при употреблении плохо очищенных стекол, грязного пинцета, наконец, в том случае, если была плохо отмыта протрава.

Если бактериальная эмульсия слишком густа, то бактерии в мазке будут скучены и картина флагелляции вследствие беспорядочного сплетения жгутиков будет неясна. Желательно подобрать такую концентрацию, чтобы в одном поле зрения находилось от 5 до 10 отдельно расположенных бактерий с хорошо расправленными жгутиками.

Заготовляемые для хранения препараты заключают в парафиновое масло или чистый канадский бальзам под покровным стеклом, иначе они быстро обесцветятся под действием света. Несмотря на то, что окрашивание жгути­ков считается одной из тонких микробиологических операций, окраска по Морозову при известной пунктуальности выполнения даже в руках начинаю­щих дает прекрасные результаты.

Способ Уварова

Особенность данного способа окраски жгутиков—отсутствие в протраве танина.

Техника окраски.

1. Культуру освежают двух- трехкратными пересевами на свежий агар и выращиванием при 37° в течение 15—16 часов.

2. Для приготовления эмульсии в физиологический раствор, налитый в чистую пробирку в количестве 5 мл, осторожно погружают петлю со свежей культурой для получения слабой эмульсии. Легкими круговыми вращениями пробирки между ладонями эмульсию равномерно смешивают, затем добавляют в нее одну каплю формалина.

3. Для окраски приготовляют:

а) насыщенный водный раствор калийных квасцов;

б) раствор: сульфаниловой кислоты 0,5 г + соляной кислоты 1,5 мл + 100 мл дистиллированной воды;

в) раствор Мюра: насыщенного водного раствора калийных квасцов 25 мл + насыщенного спиртового раствора генцианвиолета - 5 мл;

г) насыщенный спиртовой раствор основного фуксина. Растворы «а» и «б» смешивают в пропорции 1 : 2. Растворы «в» и «г» смешивают в пропорции 3 : 1.

4. Окраска. Пастеровской пипеткой наносят на чистое предметное текло каплю эмульсии и подсушивают препарат в термостате; на высох­ший нефиксированный препарат наливают смесь растворов «а» и «б», подогре­вают над пламенем при слабом отхождении паров 1—2 минуты, смывают водой и слегка высушивают. Затем на препарат наливают смесь красок «в» и «г» (раствор Мюра и насыщенный спиртовой раствор основного фуксина), нагревают препарат 1—2 минуты до слабых паров, обильно промывают и высушивают.

Микроскопическая картина: жгутики—ярко красно-фиолетового или розовато-фиолетового цвета, тела бактерий—густо фиолетовые.

Способ Леффлера

Приготовленный препарат осторожно фиксируют на пламени горелки и обрабатывают при подогревании в течение 0,5—1 минуты протравой следующего состава: 20% водного раствора танина – 100 мл + насыщенного на холоду водного раствора сернокислого закисного аммиач­ного железа 50 мл + насыщенного спиртового раствора основного фуксина 10 мл. Препарат тщательно обмывают слабой струей воды и слегка высуши­вают на воздухе, затем окрашивают карболовым раствором фуксина при подогревании в течение 2—3 минут, промывают водой и высушивают.

Способ Инуйе

Препарат, приготовленный со всеми предосторожностями, подогревают до появления паров в течение 1—1,5 минут в леффлеровской протраве (см. выше способ Леффлера). Затем протраву смывают водой до прекращения отхождения краски и окрашивают мазок в растворе Мюра, предварительно смешанном и профильтрованном (см. способ Уварова), над пламенем в течение 1-2 минут. Препарат после окраски промывают водой.

Бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый, а жгутики—в бледно-фиолетовый, красноватый цвет.

Способ Бениньетти и Джино

За 2—3 дня до окраски готовят следующие растворы:

1) сернокислого цинка 1г + 15г танина + дистиллированной воды 100 мл;

2) насыщенный (при нагревании!) водный раствор квасцов;

3) насы­щенный спиртовой раствор генцианвиолета.

Непосредственно перед окраши­ванием указанные растворы смешивают в пропорции 1 : 2 : 3, смесь обязательно фильтруют, затем наливают на фиксированный препарат, подогревают в течение 2—3 минут, после чего препарат тщательно промывают водой и высу­шивают.

Микроскопическая картина: тела бактерий—темно-фиолетового цвета, жгутики—более нежной окраски. Обычно не во всех точках препарат одинаково хорошо и равномерно окрашивается.

Этот способ наиболее доступен для начинающих и дает вполне удовлет­ворительные результаты.