Лабораторна діагностика захворювань, що спричиняються ортоміксовірусами і параміксовірусами

Грип

Грип – гостре респіраторне захворювання людини, яке має тенденцію до епі­демічного поширення. Характеризується катаральним запаленням верхніх дихальних шляхів, гарячкою, вираженою загальною інтоксикацією. Часто грип супроводжується виникненням тяжких ускладнень – вторинних бактеріальних пневмоній, загостренням хронічних захворювань легень.

Збудники грипу належать до родини Orthomyxoviridae. Вона включає три роди вірусів – А, В, С.

Вірус грипу має сферичну форму, його розміри 80-120 нм. Деколи утворюються ниткоподібні віріони. Геном утворений однонитковою мінус-ниткою РНК, яка складається з восьми фрагментів, і оточений білковим капсидом. РНК асоційована з 4 внутрішніми білками: нуклеопротеїдом (NP) і високомолекулярними білками Р1, Р2, Р3, які беруть участь у транскрипції геному та реплікації вірусу. Нуклеокапсид має спіральний тип симетрії. Над капсидною оболонкою знаходиться шар матрикс­ного білка (М протеїн). На зовнішній, суперкапсидній оболонці у вигляді шипиків розміщені гемаглютинін (Н) і нейрамінідаза (N). Обидва глікопротеїни (N i H) мають виражені антигенні властивості. У вірусів грипу знайдено 13 різних антигенних типів гемаглютині­ну (H1-13) та 10 варіантів нейрамінідази (N1-10).

За внутрішнім нуклеопротеїдним антигеном розрізняють три типи вірусів грипу – А, В, С, які можна визначити в РЗК. У вірусів типу А, які вражають людину, є три різновидності гема­глютиніну (Н1, Н2, Н3) і дві – нейрамінідази (N1, N2). Залежно від їх комбінацій, виділяють варіанти вірусів грипу А – H1N1, H2N2, H3N2. Їх визначають у реакції гальмування гемаглютинації з відповідними сироватками.

Віруси грипу легко культивуються в курячих ембріонах і різноманітних культурах клітин. Максимальне нагромадження вірусів відбувається через 2-3 дні. У зовнішньому середовищі вірус швидко втрачає ін­фек­ційність через висушування. При низькій температурі в холодильнику зберігається протягом тижня, при ‑70 °С – значно довше. Нагрівання призводить до його інактивації через кілька хвилин. Під впливом ефіру, фенолу, формаліну швидко ­руйнується.

Вірусологічний метод діагностики. Матеріалом для дослідження є змиви з носоглотки, виділення з носа, які беруть сухими або вологими стерильними ватними тампонами в перші дні захворювання, харкотиння. Віруси можна також знайти в крові, спинномозковій рідині. При летальних випадках забирають шматочки уражених тканин верхніх і нижніх дихальних шляхів, головного мозку тощо.

Носоглоткові змиви беруть натщесерце. Хворий повинен тричі ­прополоскати горло стерильним ізотонічним розчином хлориду натрію (10-15 мл), який збирають у стерильну банку з широким горлом. Після цього шматочком стерильної вати протирають задню стінку глотки, носові ходи, потім її занурюють у банку із ­змивом.

Можна взяти матеріал стерильним, зволоженим в розчині хлориду натрію тампоном, яким ретельно протирають задню стінку глотки. Після забору матеріалу тампон занурюють у пробірку з ізотонічним розчином, до якого добавлено 5 % інактивованої сироватки тварин. У лабораторії тампони полощуть у рідині, віджимають біля стінки пробірки і видаляють. Змив витримують у холодильнику для відстоювання, потім відбирають середню частину рідини в стерильні пробірки. До матеріалу додають антибіотики пеніцилін (200-1000 ОД/мл), стрептоміцин (200-500 мкг/мл), ністатин (100-1000 ОД/мл) для знищення супутньої мікрофлори, витримують 30 хв при кімнатній температурі і використовують для виділення вірусів, попередньо перевіривши його на стерильність.

Найчутливішим методом виділення вірусів є зараження 10-11-денних курячих ембріонів. Матеріал в об’ємі 0,1-0,2 мл вводять в амніотичну або алантоїсну порожнини. Заражають, як правило, 3-5 ембріонів. Ембріони інкубують при оптимальній температурі 33-34 °С протягом 72 год. З метою збільшення кількості віріонів у досліджуваному матеріалі його попередньо концентрують. Для цього використовують методи адсорбції вірусів на курячих еритроцитах, обробку 0,2 % розчином трипсину з метою підсилення інфекційних властивостей вірусів або осаджують їх за спеціальними методиками.

Після інкубації курячі ембріони охолоджують при температурі 4 °С протягом 2-4 год, потім відсмоктують стерильними піпетками або шприцем алантоїсну чи амніотичну рідину. У ній за допомогою РГА визначають наявність інфекційного вірусу. Для цього змішують рівні об’єми (0,2 мл) вірусмісткого матеріалу і 1 % зависі еритроцитів курей. Про позитивну реакцію (наявність вірусу в матеріалі) свідчить осідання еритроцитів у вигляді парасольки.

За умови наявності в матеріалі вірусу, який має гемаглютинуючі властивості, його титрують за допомогою розгорнутої РГА, визначаючи титр гемаглютинуючої активності.

Схема титрування вірусів за допомогою РГА

За допомогою цієї реакції визначають титр гемаглютинуючого вірусу – най­більше розведення матеріалу, яке ще дає реакцію гемаглютинації. Цю кількість вірусу приймають за одну гемаглютинуючу одиницю (ГАО).

Ідентифікують віруси грипу за допомогою РГГА. Для цього спочатку готують робоче розведення вірусного матеріалу, яке містить 4 ГАО вірусу в певному об’ємі.

Облік реакції проводять після утворення осаду еритроцитів в контрольних лунках. Про позитивну реакцію свідчить затримка гемаглютинації в досліджуваних лунках.

Виділяти віруси грипу можна, використовуючи різноманітні лінії культур клітин – ембріону людини, нирок мавп, перещеплювані лінії клітин нирок собаки (MDCK) тощо. У клітинних культурах проявляється цитопатична дія вірусів (поява клітин з фестончастими краями, вакуолями, формування внутрішньоядерних і цитоплазматичних включень), яка завершується дегенерацією моношару клітин.

Для ідентифікації виділених вірусів використовують РГГА (за умови, якщо титр гемаглютинінів становить у культуральній рідині не менше 1:8). Крім цієї реакції, можна використати РГГ_адс, однак вона є менш чутливою і вимагає титру імунної сироватки не менше, ніж 1:160_, а також РЗК, РН, РЕМА тощо.

Серологічне дослідженнявикористовують для підтвердження діагнозу грипу. Воно грунтується на визначенні чотирикратного зростання титру антитіл у сироватці хворого.

Першу сироватку отримують на початку хвороби в гострому періоді (2-5-й день хвороби), другу – після 10-14-го дня захворювання. Оскільки сироватки дослі­джують одночасно, першу з них зберігають у холодильнику при температурі ‑20 °С.

Найчастіше використовують РГГА, РЗК, РНГА. Ці реакції ставлять із спеці­альними наборами стандартних вірусних діагностикумів (еталонні штами вірусів грипу різних серологічних типів). Оскільки сироватки хворих можуть містити неспецифічні інгібітори гемаглютинації, їх спочатку прогрівають при температурі 56 °С, а також обробляють спеціальним ферментом (наприклад, нейрамінідазою) або розчинами перйодату калію, риванолу, хлориду марганця, суспензією білої глини тощо за спеціальними схемами.

Реакцію гальмування гемаглютинації можна ставити в пробірках (макрометод) або в спеціальних планшетах для імунологічних досліджень (мікрометод). Схема постановки РГГА наведена в таблиці.