Этап. Инокуляция продуцента антибиотика в жидкую питательную среду и на сыпучий субстрат.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №2

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Изучить технологию культивирования продуцента анти­биотика в глубинной и поверхностной культурах.

ПРОГРАММА РАБОТЫ

1. Ознакомиться с основными сведениями о процессе поверхностной и глу­бинной ферментации микроорганизмов и факторами, влияющими на этот процесс.

2. Провести в стерильных условиях посев микроорганизма — продуцента антибиотика в питательные среды: жидкую и на сыпучий субстрат.

3. Провести описание характера развития продуцента ан­тибиотика на агаризованной среде.

4. Осуществить процесс глубинной и поверхностной ферментации соответственно в жидкой питательной среде и сыпучем субстрате.

ОСНОВНЫЕ СВЕДЕНИЯ

Микроорганизмы являются неиссякаемым источником различных полезных для человека веществ. Среди них особое место занимают микроорганизмы, обра­зующие антибиотики, ферменты, аминокислоты, витамины и др. соединения.

Антибиотики — это низкомолекулярные вещества, выраба­тываемые микроорганизмами в процессе их жизнедеятельности, преимущественно в стационарной фазе. В промышленных условиях культивирование продуцентов антибиотиков осуществляется в ферментерах.

Основные условия процесса ферментации. Для успешного проведения процесса ферментации и дос­тижения высокого уровня накопления антибиотика помимо использования оптимальной среды, необходимо соблюдать определенные условия ведения процесса:

— поддерживать необходимую температуру;

— соблюдать оптимальное значение рН среды и культуральной жидкости в процессе ферментации;

— обеспечивать культуру достаточным количеством кислорода;

— не допускать интенсивного вспенивания;

— не допускать загрязнения культуры продуцента посто­ронними микроорганизмами;

Температура

Для биосинтеза каждого антибиотика требуется опреде­ленная температура. Так, для биосинтеза пенициллина гри­бом Репicyllium сhrуsоgепiит оптимальной является температура 25 - 26°С, в то время как при образовании антибиотиков актиномицетами обычно поддерживают более высокую температуру — 27-29°С. Однако этот уровень температуры не является наилучшим для биосинтеза всех антибиотиков, которые обра­зуются актиномицетами. При биосинтезе, например, эритромицина культурой Streptomyces еrуthrеus наиболее благоприятной является тем­пература 31—32 °С. В процессе ферментации вследствие интенсивно проте­кающих процессов выделяется значительное количество теп­ла. Поэтому для поддержания температуры на желательном уровне необходимо постоянное охлаждение среды.

рН среды

Для биосинтеза большинства известных антибиотиков оп­тимальное значение рН близко к нейтральному. При значительном закислении или защелачивании среды процесс биосинтеза тормозится. Кроме того, многие антибиотики – целевые продукты ферментации - в щелочных или кислых условиях неустойчивы и быстро инактивируются. Изменение рН среды в процессе ферментации зависит в основном от состава питательной среды и характера про­цесса метаболизма. Для регулирования рН в питательные среды для получе­ния антибиотиков часто добавляют некоторое количество кальция карбоната. Мел реагирует с образующимися в процессе метаболиз­ма кислотами, образуя нейтральные соли и углекислый газ, который удаляется из среды. Поэтому наличие в среде кальция карбоната пре­дотвращает возможность нежелательного закисления среды.

Аэрация и перемешивание

Все продуценты антибиотиков являются аэробными мик­роорганизмами и требуют для роста и развития наличия рас­творенного кислорода. Во время ферментации происходит одновременно два процесса — растворение кислорода в питательной среде и потребление кислорода микроорганизмами. Микроорганизмы используют для дыхания только рас­творенный в среде кислород, поэтому обеспеченность микро­организмов кислородом определяется скоростью его растворе­ния в культуральной жидкости. При глубинном культивировании микроорганизмов в промышленных масштабах этот процесс осуществляется путем пропускания воздуха через питательную среду и культуральную жидкость с помощью специальных аэрирующих приспособлений — барботеров. При этом жидкость одновре­менно интенсивно перемешивается. Основное назначение аэрации и перемешивания — снабжение культуры кислородом, одновременно эти процессы способствуют поддержанию клеток в равномерно взвешенном состоянии и выравниванию концентрации пита­тельных веществ и продуктов обмена в культуральной жидкости. При проведении глубинной ферментации в лабораторных условиях степень аэрации зависит от частоты и интенсивности перемешивания жидкости в колбе.

Вспенивание

Питательные среды, применяемые при получении анти­биотиков, содержат вещества, способные образовывать весь­ма стойкие пены. Аналогичные вещества могут возникать в процессе ферментации. Аэрация и перемешивание среды вызывают образование слоя пены на поверхности жидкости, что ухудшает условия развития продуцента. Борьба с пенообразованием, т. е. пеногашение, осуществ­ляется главным образом путем добавления веществ, способствующих снижению стойкости пены и в дальнейшем ее разрушению. В качестве таких ве­ществ в отечественной промышленности применяют различ­ные жиры и жидкие растительные масла.

Стерильность процесса

Отсутствие посторонней микробиоты при выращивании продуцентов антибиотиков является одним из наиболее важных факторов. Развитие посторонней микробиоты опасно во многих отношениях:

1. Посторонние микроорганизмы, развиваясь в питательной среде, видоизменяют ее и тем самым нарушают оптимальные для биосинтеза антибиотика условия, что приводит к снижению его накопления;

2. Наличие посторонней микробиоты затрудняет дальнейшую обработку культуральной жидкости, отделение ее от клеток (мицелия) и приводит к получению некачественного нативного раствора

3. Продукты жизнедеятельности посторонних микроорганизмов могут загрязнять получаемый антибиотик и снижать его качество

ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

Работа выполняется в три этапа.

1 Этап. Определение чистоты культуры продуцента антибиотика на плотной (агаризованной) среде и выбор объектов для инокуляции жидкой Питательной среды и сыпучего субстрата.

Извлеките из термостата свои объекты, приготовленные на занятии №1. Внимательно рассмотрите картину роста микроорганизма на плотной среде в чашке Петри и в пробирке через стекло, НЕ ВСКРЫВАЯ их. Если требуется, сотрите надписи ватным тампоном, смоченным спиртом. Сравните и выявите степень однородности картины.

Если все участки роста в чашке Петри однородны и идентичны таковым в пробирке, чужеродные элементы отсутствуют, то можно сделать вывод об успешном выделении Вами чистой культуры микроорганизма. Выполните инокуляцию культуры в жидкую питательную среду (ПС) и сыпучий субстрат как указано ниже (см. 2 этап).

Описание культуры выполните за пределами асептического блока, после вскрытия чашки Петри и пробирки и осуществления инокуляции.

Если картина роста неоднородна, имеются колонии или участки роста, различающиеся по внешнему виду или инородные вкрапления, отличающиеся по цвету, характеру кромки, высоте, характеру опушения и т.д., то вывод о чистоте выделенной культуры сделать нельзя. Посев в жидкую ПС возможен только после изучения и идентификации всех выявленных объектов роста и выбора подходящего объекта. Выполните препараты «отпечаток» со всех выявленных объектов (см. ниже), строго соблюдая правила асептики и принимая максимальные меры предосторожности для исключения перекрестного загрязнения колоний. Подпишите приготовленные препараты с целью их идентификации. Изучите приготовленные «отпечатки» под микроскопом за пределами асептического блока и, по-возможности, выберите подходящий объект для посева в жидкую ПС. Если подходящие объекты отсутствуют, то работу по выделению чистой культуры продуцента необходимо выполнить повторно с самого начала (см. занятие №1).

Этап. Инокуляция продуцента антибиотика в жидкую питательную среду и на сыпучий субстрат.

Инокуляция культуры - продуцента антибиотика в жидкую ПС осуществляется с целью глубинного культивирования его и выделения антибиотика.

Все процедуры, связанные с подготовкой сред и инокуляцией продуцента проводятся в подготовленном асептическом блоке при выполнении надлежащих правил асептики. В тамбур-шлюзе асептического блока необходимо:

1. снять переходную одежду

2. вымыть с мылом руки, обращая особое внимание на околоногтевые пространства. Следует пользоваться стерильной щеткой для рук. Высушить руки с помощью электрополотенца.

3. Надеть комплект стерильной технологической одежды (халат, шапочку и четырехслойную марлевую повязку), освободив его от упаковки. Волосы тщательно убирают под шапочку.

4. Обработать руки дезинфицирующим средством «для рук». Для этого 2-3 мл средства втирать в кожу кистей и запястья до полного его высыхания. Руки НЕ ВЫТИРАТЬ и НЕ СУШИТЬ электрополотенцем.

5. Пройти в асептический блок, включить ламинарный шкаф и приступить к работе.

инокуляция культуры продуцента антибиотика в жидкую питательную среду

Осуществляется в асептическом блоке

а) Включить ламинар.

б) При работающем ламинаре подготовить все необходимое для работы.

в) Протереть поверхность стола дезинфицирующим рас­твором.

г) Выключить ламинар и зажечь спиртовку.

д) Взять в правую руку бактериологическую петлю и простерилизовать ее в пламени горелки.

е) Не выпуская из руки петли, левой рукой слегка приоткрыть чашку Петри с чистой культурой и ввести бактериологическую петлю. Охладить петлю, прижав ее к крышке чашки. Выбрать участок наиболее богатого роста и за­хватить культуру микроорганизма вместе со средой площадью около 1 см². Закрыть чашку.

Если культура в чашке Петри не «чистая», можно использовать культуру в пробирке.

и) Удерживая петлю указательным и большим пальцами правой руки, захватить мизинцем и безымянным пальцем ват­ную пробку колбы, прижать ее к ладони и открыть колбу около пламени горелки. Опустить петлю с культурой в жидкую пи­тательную среду. Извлечь петлю и асептически закрыть колбу.

к) Петлю обжечь в пламени горелки. Пламя горелки загасить.

л) Перемешать осторожными вращательными движениями содержимое колбы.

Колбу с посеянной культурой актиномицета подписать карандашом по стеклу и поместить в термостат при 28 °С. Продолжительность ферментации — 7 суток (170 часов).

В процессе ферментации необходимо ежедневно в асептических условиях производить аэрацию культуры и перемешивание (выполняет лаборант).

инокуляция культуры продуцента антибиотика на сыпучий субстрат

Посев микроорганизма-продуцента фермента на сыпучий субстрат осуществляют взвесью клеток и спор микроорганизма стерильным шприцем (микробиологической пи­петкой).

Взвесь клеток и спор микроорганизма готовят путем смыва их с поверхности агаризованной среды стерильной водой (физиологическим раствором). Полученную взвесь переливают в колбу, содержащую стерильный субстрат.

Порядок работы:

а) Включить ламинар, должен работать не менее 2 мин

б) Протереть поверхность стола дезинфицирующим рас­твором.

в) Выключить ламинар и зажечь спиртовку.

г) Асептически с помощью абразива вскрыть ампулу со стерильной водой или физиологическим раствором, провести через пламя спиртовки.

д) Стерильный шприц на 2 мл освободить от упаковки, провести через пламя спиртовки и набрать 2 мл содержимого ампулы.

е) Взять в левую руку пробирку с чистой культурой продуцен­та. Если культура в пробирке не «чистая», можно использовать культуру в чашке Петри.

ж) Не выпуская из руки шприца, мизинцем и безымянным пальцем правой руки прижать ватно-марлевую пробку пробир­ки к ладони, вынуть ее из пробирки. В пробирку ввести шприц и влить в нее все содержимое шприца. Пробирку закрыть пробкой, вращательными движениями распределить жидкость по поверхности агара и осторожно перемешать, собирая клетки и споры продуцента.

з) Возле пламени горелки открыть пробирку, предварительно проведя край через пламя и набрать шприцом (также проведенным через пламя) взвесь клеток и спор продуцента. Вынуть шприц из пробирки, закрыть пробирку пробкой и поместить в штатив.

и) Удерживая шприц пальцами правой руки, захватить мизинцем и безымянным пальцем ватную пробку колбы с сыпучим субстратом, прижать ее к ладони и открыть колбу около пламени горелки. Ввести шприц в колбу и вылить его содержимое, равномерно распределяя взвесь по всей поверхности зерна. Закрыть колбу ватно-марлевой пробкой, проведя ее через пламя.

к) Шприц закрыть крышкой (далее использовать для приготовления препарата «раздавленная капля»).

л) Колбу с сыпучим субстратом осторожно потрясти для равномерного распределения культуры по всей поверхности субстрата (зерен перловой крупы), подписать и поместить в термостат для культивирования при 28°С. Продолжительность выращивания — 7—10 суток.

После осуществления посева приступайте к выполнению 3 этапа, который следует выполнять за пределами асептического блока.