Ионообменная хроматография
Вопрос 5
Очистка белков избирательной денатурацией Большинство белков денатурирует и выпадает в осадок уже при кратковременном нагревании раствора до 50-70 °С или подкислении раствора до рН 5. Если выделяемый белок выдерживает эти условия, то с помощью избирательной денатурации можно удалить большую часть посторонних белков, отфильтровав выпавшие в осадок-белки, или осадить их центрифугированием.
Высаливание – это процесс осаждения белков нейтральными солевыми растворами щелочных и щелочноземельных металлов.
Механизм высаливания – добавляемые анионы и катионы разрушают гидратную белковую оболочку белков, являющуюся одним из факторов устойчивости белковых растворов. Чаще всего применяются растворы сульфатов Na и аммония. Многие белки отличаются по размеру гидратной оболочки и величине заряда. Для каждого белка есть своя зона высаливания. После удаления высаливающего агента белок сохраняет свою биологическую активность и физико-химические свойства. В клинической практике применяется метод высаливания для разделения глобулинов ( при добавлении 50% раствора сульфата аммония (NH4)2SO4 выпадает осадок) и альбуминов ( при добавлении 100% раствора сульфата аммония (NH4)2SO4 выпадает осадок).
На величину высаливания оказывают влияние:
1) природа и концентрация соли;
2) рН-среды;
3) температура.
Главную роль при этом играют валентности ионов. Поэтому действие соли оценивают по ионной силе раствора μ:
, то есть ионная сила раствора (μ) равна произведению ½ концентрации каждого иона (С) на квадрат его валентности (V).
Метод Кона является разновидностью высаливания. Одновременно происходит экстракция и осаждения компонентов. Изменяя последовательно температуру (обычно низкие to –0+8oС), рН раствора и концентрированного этанола, из плазмы крови последовательно выделяют до 18 фракций белков.
Метод Кона применяют в фармацевтическом производстве при получении кровезаменителей;
Вопрос 6
Метод разделения белков с помощью гель-фильтрационной хроматографии основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества (сефадекс, агароза и др.). В структуре полисахарида образуются поперечные связи и формируются гранулы с "порами", через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. В зависимости от условий можно формировать гранулы с разной величиной "пор".
Неподвижная фаза - жидкость внутри гранул, в которую способны проникать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой. Смесь белков, нанесённую на хроматографическую колонку, вымывают (элюируют), пропуская через колонку растворитель. Вместе с фронтом растворителя движутся и самые крупные молекулы.
Более мелкие молекулы диффундируют внутрь гранул сефадекса и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего их движение задерживается. Величина пор определяет размер молекул, способных проникать внутрь гранул (рис. 1-55).
Так как гелевая структура сефадекса легко деформируется под давлением, гели стали заменять более жёсткими матрицами (сефактил, той-оперл), представляющими сферические гранулы с разными размерами пор. Выбор размеров пор в гранулах зависит от целей хроматографии (о других хроматографических методах будет сказано ниже).
Ионообменная хроматография
Метод основан на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий.
В качестве неподвижной фазы используют ионообменники - полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы.
Различают положительно заряженные анионообменники, среди которых наиболее часто используют диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлозу), содержащую катионные группы, и отрицательно заряженные катионообменники, например карбоксиметилцеллюлозу (КМ-цел-люлозу), содержащую анионные группы.
Выбор ионообменника определяется зарядом выделяемого белка. Так, для выделения отрицательно