Качественные пробы на присутствие ферментов

Опыт 1. Качественная проба на сахаразу.

В две пробирки берут по 0,5 мл раствора сахаразы. Содержимое одной пробирки кирятят для разрушения фермента и охлаждают. Затем в обе пробирки прибавляют по 3 мл раствора сахарозы и инкубируют при 40ºС в течении 10-15 мин. Затем в обе пробирки добавляют по 2 мл фелинговой жидкости и нагревают до начинающегося кипения. Полученные результаты заносят в таблицу:

Пробирка	Окраска
Кипяченная
некипяченная

Объясните полученные результаты.

Вывод:

Опыт 2. Открытие амилазы в слюне

1. Приготовление разбавленной слюны

Ополаскивают 2-3 раза рот для удаления остатков пищи. Отмеряют 50 мл дистиллированной воды и ополаскивают ею рот в течении 3-5 минут в несколько приёмов. Собранную жидкость фильтруют через вату и фильтрат используют для работы.

2. Гидролиз крахмала под действием слюны.

В две пробирки наливают по 5 мл крахмального клейстера и в одну из них 5 мл воды, а в другую – 5 мл слюны. Обе пробирки со стеклянными палочками одновременно помещают на водяную баню при 40ºС. Через 1 минуту из каждой пробирки берут по капле (при помощи палочки) и смешивают её с заранее нанесённой на предметное стекло каплей раствора йода. Повторяют исследование через 2, 4, 6, 8 минут. После этого в пробирки наливают по 2 мл фелинговой жидкости и нагревают на пламени спиртовки до начала кипения. Полученные данные заносят в таблицу:

Окраска	Опытная пробирка (со слюной)	Контрольная пробирка (с водой)
Через 1 мин.
Через 2 мин.
Через 4 мин.
Через 6 мин.
Через 8 мин.
С фелинговой жидкостью

Делают вывод о действии амилазы на крахмал.

Вывод:

Контрольные вопросы

Какова биологическая роль ферментов и что они из себя представляют по химическому строению?
Перечислите основные свойства ферментов.

3. Обьясните, что входит в понятие «Активный центр фермента»? Приведите примеры строения активного центра 2-3х ферментов.

4. В каких единицах выражают активность ферментов?

СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ

Нумеруют 4 пробирки, сливают реактивы по следующей схеме:

№	2 мл р-ра крахмала	2 мл р-ра сахарозы	0,5 мл слюны	0,5 мл р-ра сахаразы
	+	-	+	-
	+	-	-	+
	-	+	+	-
	-	+	-	+

Перемешивают содержимое и ставят в водяную баню на 10 минут при 37-40ºС. После охлаждения проделывают реакции с йодом на присутствие крахмала в пробирках 1 и 2, с фелинговой жидкостью на присутствие сахарозы в пробирках 3 и 4. На основании полученных результатов сделайте вывод о специфичности действия амилазы и сахаразы.

Вывод:

Контрольные вопросы

Что понимают под специфичностью действия ферментов? Какие подходы используют для выяснения специфичности действия ферментов?
Виды специфичности ферментов.

Лабораторная работа №6

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ГЛИЦИЛ-ГЛИЦИН-ДИПЕПТИДАЗЫ

В животных тканях обнаружена система дипептидаз (дипептид-гидролазы КФ 3.4.3), которые обладают определённой, часто весьма строгой, субстратной специфичностью. Существование различных дипептидаз имеет большое биологическое значение для распада белковых молекул до свободных аминокислот. Эти ферменты обеспечивают расщепление самых различных пептидных свчзей, в частности, таких, которые не гидролизуются другими протеолитическими ферментами.

Глицил-глицин-дипептидиза (диглициназа) гидролизует глицил-глицин и не действует на другие дипептиды. Однако, несмотря на такую узкую специфичность, фермент широко распространён в животных тканях (печень, почки, скелетные мышцы, слизистая кишечника, мозг и др.). Гидролиз глицил-глицина может осуществляться также некоторыми другими ферментами, однако только глицил-глицин дипептидаза сильно активируется ионами Co².

Принцип метода

Метод основан на расщеплении диглициназой глицил-глицина в присутствии ионов Co². Продукт (глицин) определяется нингидриновым методом.

Реактивы и оборудование

· Весы (торзионные, аналитические, технические), полиэтиленовые пробирки, гомогенизатор, центрифуга настольная, ультратермостат, фотоэлектроколориметр, пробирки, пипетки, штативы, колонка для обессаливания и пр.

· 100 мМ Трис-ацетатный буфер, pH=5,6; 7,6; 8,5.

· 3,5 мМ CoSO4 на буфере (98 мг CoSO4 * 7H2O растворяют в 100 мл воды).

· Раствор субстрата (1 мг глицил-глицина растворяют в 1 мл воды).

· 0,5 М цитратный буфер, pH=5,5.

· Нингидриновый реактив (готовят перед опытом в количестве, необходимом для опыта). 8 мг нингидрина растворяют при нагревании в 1 мл цитратноо буфера, прибавляют 2 мл глицерина и тщательно перемешивают. ВНИМАНИЕ: нингидрин – яд! Необходимо избегать попадания нингидрина и нингидринового реактива на руки и вовнутрь).

· Стандартный раствор глицина (0,005 М).

Ход работы

Цветная реакция

В пробирки диаметром 12-14 мм отбирают по 60 мкл надосадочной жидкости, прибавляют по 1 мл нингидринового реактива, тщательно встряхивают и помешают на 12 минут в кипящую водяную баню. Интенсивность окраски измеряют на фотоэлектроколориметре против воды в микрокюветах при светофильтре 590 нм.

Опыт 1. Построение калибровочной кривой

В 6 пробирках смешивают следующие количества стандартного раствора глицина и воды:

№ пробирки	Раствор глицина (мл)	Вода (мл)	Содержание глицина / (моль)	Оптическая плотность
1.	Чистая вода
2.			0,001
3.			0,002
4.			0,003
5.			0,004
6.	Неразведённый глицин	0,005

Тщательно перемешивают, в пробирки диаметром 12-14 мм отбирают по 60 мкл растворов и проводят цветную реакцию, как описано выше. Фотоэлектроколориметрирование проводят против пробы, содержащей воду. Полученные результаты заносят в таблицу и строят график зависимости оптической плотности от концентрации глицина.

Опыт 2. Определение активности фермента

Навеску печени (0,5 г) гомогенизируют в гомогенизаторе Поттера в 5 мл охлаждённого 100 мМ Трис-HCl буфера, pH 7,6. Для проведения ферментативной реакции берут 4 пробирки (2 опытные, 2 контрольные) и производят добавление реактивов по схеме на с. 32.

В пробирки диаметром 12-14 мм отбирают по 60 мкл надосадочной жидкости и проводят цветную реакцию, как описано выше. Фотоэлектроколориметрирование проводят против дистиллированной воды.

№ п/п	Операции	Опытные пробы	Контрольные пробы
1.	100 мМ Трис-ацетатный буфер, pH 7,6	-	30 мкл
2.	3,5 мМ CoSO4	20 мкл	-
3.	Гомогенат	40 мкл	40 мкл
4.	Инкубация при 37ºС	8 мин.	8 мин.
5.	Раствор субстрата	10 мкл	-
6.	Инкубация при 37ºС	30 мин.	30 мин.
7.	5% раствор ТХУ	30 мкл	30 мкл
8.	Центрифугирование	30 мин. при 4000 об/мин	30 мин. при 4000 об/мин

Опыт 3. Исследование влияния времени инкубации на активность фермента

Навеску печени (0,5 г) гомогенизируют в гомогенизаторе Поттера в 5 мл охлаждённого 100 мМ Трис-HCl буфера, pH 7,6. Для проведения ферментативной реакции берут 12 пробирок (6 опытных, 6 контрольных) и определяют активность диглициназы, как описано в опыте 2. Только одни 2 опытные и 2 контрольные пробирки после прибавления глицил-глицина инкубируют 10 минут, вторые – 20 минут, третьи – 30 минут.

Опыт 4. Исследование влияния pH на активность фермента

Навеску печени (0,5 г) гомогенизируют в гомогенизаторе Поттера в 5 мл охлаждённой дистиллированной воды. Для проведения ферментативной реакции берут 12 пробирок (4 для pH 5,6 (2 опытные, 2 контрольные), 4 для pH 7,6 (2 опытные, 2 контрольные), 4 для pH 8,5 (2 опытные, 2 контрольные) и определяют активность диглициназы, как описано в опыте 2, используя соответсвующие буферные растворы.

В опытах 2-4 по калибровочному графику находят количество глицина, образовавшееся при гидролизе глицил-глицина, и рассчитывают активность глицил-глицин-дипептидазы в расчёте на 1 мг ткани.

Содержание отчёта

Опыт 1.Калибровочный график.

Опыт 2.Таблица.

Dоп.	Dконт.	Dоп. ср.	Dконт. ср.	Dоп. ср. - Dконт. ср.	Активность

Опыт 3.1.Таблица.

Время инкубации	Dоп.	Dконт.	Dоп. ср.	Dконт. ср.	Dоп. ср. - Dконт. ср.	Активность
10 мин.
20 мин.
30 мин.