Таксономия бактериофагов молочнокислых микроорганизмов

В основе процесса выработки ферментированных молочных продуктов, в том числе ПФП с пробиотиками, лежит ферментация лактозы в молоке под действием микроорганизмов.

Наиболее часто встречающейся и трудно устранимой причиной является поражение заквасочной микрофлоры бактериофагами.

В результате поражения многокомпонентной закваски фагом часть заквасочных микроорганизмов (или все) лизируются, что приводит к снижению пробиотической активности ПФП, а в крайнем случае – полному прекращению нарастания кислотности и невозможности выработать качественный продукт [422].

Предотвращение фаголизиса при производстве ферментированных молочных продуктов включает мероприятия по контролю и ограничению развития фагов при угрозе фаголизиса и окончательном подтверждении роли фага как причины выработки некачественного продукта.

Наблюдение (контроль), оценка и прогноз фаговой ситуации на предприятии получило название «фаговый мониторинг».

В широком смысле слова, фаговый мониторинг включает также принятие оперативных решений на основании полученных данных и разработку комплекса стратегических мероприятий, направленных на улучшение фаговой ситуации на предприятии.

Таблица 1.9 – Сопоставление фагологии и бактерициологии

Фагология (техническая)	Бактерициология (техническая)
Задачи
Фагология техническая – раздел прикладной микробиологии, изучающий влияние бактериофагов на технологические свойства промышленных заквасочных штаммов микроорганизмов и методологии предупреждения фаголизиса производственных заквасок	Бактерициология техническая – раздел прикладной микробиологии, изучающий антагонистическую активность заквасочных микроорганизмов с помощью бактериоцинов и методологии с их помощью нормализации микробного ценноза у человека и животных
Объект
Бактериофа́ги (фаги) – вирусы, неспособные к самостоятельному размножению, избирательно поражающие бактериальные клетки. Бактериофаги размножаются внутри бактерий и чаще всего вызывают их лизис, или, встраиваясь в факторы наледственности клетки, сосущестуют с ней (профаг). Как правило, бактериофаг состоит из белковой оболочки и генетического материала (ДНК, реже РНК). Размер частиц от 20 до 200 нм, масса 18–25 МДа. Вирулентность (количество фагов, репродуцирующихся в одной клетке одновременно) до 300 частиц	Бактериоцины – биологический феномен, широко распространенный в природе и связанный с синтезом микроорганизмами белковоподобных антибактериальных субстанций весом, как правило до 1 МДа, способных фиксироваться на специфических рецепторах других микробных клеток и оказывать на них угнетающее действие. Микробная клетка, синтезирующая бактериоцин, погибает в большинстве случаев без лизиса. Все представители микробной популяции, к которой относилась погибшая клекта, не восприимчивы к этому бактериоцину
Специфичность действия объекта
Специфичность действия бактериофагов определяется наличием рецепторов на поверхности чувствительных бактерий, ДНК-аз рестрикции-модификации и механизма абортивной инфекции внутри бактериальной клекти	Специфичность действия бактериоцинов определяется наличием рецепторов на поверхности чувствительных бактерий, на которых адсорбируются бактериоцины. Штаммы бактерий, утратившие способность синтезировать рецепторы, становятся резистентными к бактериоцинам
Фагология (техническая)	Бактерициология (техническая)
Методы разделов:
Для определения родства фагов - ДНК-ДНК гибридизация, для выявления индивидуальных различий – электронная фотография с определением размеров бактериофагов и их отделдьных частей по отношению к наиболее изученному, рестрикционный анализ ДНК фагу E.coli Т4 (рис. 2.8.), спектр литического действия и вирулентность и длительность латентного периода при стандартных условиях и др.	Для определения родства бактериоцинов используется анализ поледовательностей аминокислот. В частности лактицин 481, содержит 27 остатков аминокислот, в т.ч. дегидробутирина, лантионина и метиллантионина. Установлена полная структура бактериоцина и локализованы тиоэфирные мостики, положение которых отличается от известного для лантибиотиков других типов [167]
Взаимосвязь разделов:
В среде естественного обитания микроорганизмов за счет гибели части популяции и подавления развития других бактерий, нуждающихся в тех же питательных субстратах, обеспечивается преимущественное развитие фагоустойчивых, бактериоциногенных популяций Получить бактериоциногенную и фагоустойчивую бактериальную клетку можно естетвенным отбором, воздействием ультрафиолетовыми лучами и другими индуцирующими факторами и генно-инженерными методами Свойства устойчивости к бактериофагу и синтез бактериоцинов кодируются плазмидами и могут быть переданы бактериям того же или близкородственного вида при совместном культивировании путем конъюгации И бактериофаги, и бактериоцины, в силу эволюционно-высокой рекомбинации, имеют неограниченно большое число моновидуумов, но, в силу родственных признаков, классифицируются по таксонам, что помогает более эффективному решению задач фагологии и бактериологии

Предупреждение и ограничение развития бактериофагов можно достичь двумя путями: с одной стороны, обеспечением асептического выращивания (или активизации) заквасок с целью предупреждения его попадания из окружающей атмосферы, с оборудования и персонала, с другой – препятствием деятельности фагов посредством применения противофаговых сред, ротации, создания заквасок с оптимальными защитными свойствами.

При поддержании асептического режима необходимо учитывать, что бактериофагфаг устойчив к высоким температурам, а также ко многим инактивирующим агентам [296]. Установлено, что фаг более устойчив к нагреванию, чем его штамм-хозяин и подавляющее большинство вегетативной микрофлоры. Пастеризацией молока при температуре 72–75°С с выдержкой 20 сек и при 89° без выдержки достигнуто было только частичное инактивирование бактериофагов лактококков.

Для полной инактивации бактериофагов молоко следует пастеризовать при (90+1) 1 мин или применять более низкие температуры при более длительной экспозиции (63°С – 30 мин, 85 °С – 10 мин) [152]. Использование противофаговой среды, не содержащей кальция, осложняется тем, что не все закваски хорошо растут на такой среде [4, 152].

Наиболее эффективными дезинфицирующими средствами, инактивирующими бактериофаг, которые могут быть применены в пищевой промышленности считают: гипохлорид, диэтиловый эфир пировиноградной кислоты. Выявлена довольно значительная способность хлорной извести, четвертичных аммонийных соединений [163], эстерола [237], диэтилкарбоната [394], ультрафиолетового облучения к уничтожению бактериофагов.

При действии ультрафиолетового облучения фаг лактококков активируется только в том случае, если он подвергался действию лучей в тонком слое среды. Эффективность применения ультрафиолетовых лучей на фаг в воздухе: пятиминутное облучение воздуха ультрафиолетом (длина волны 2357 А) приводит к сильному снижению количества фага, а 25-минутное – к полной его инактивации [359, 556 и др.]. Из синтетических моющих средств, используемых в отечественной молочной промышленности для дезактивации фага, рекомендуют растворы вимола и триаса в концентрации 0.5–1.0% с 2-минутной продолжительностью контакта с обрабатываемой поверхностью при 60–70°С и минутной – при температуре 45–50°С.

Исследования фаговой ситуации на молочных предприятиях России и ближнего зарубежья показали [422], что за последние десятилетия не только увеличилась концентрация выявляемых на заводах фагов, но и расширился спектр литической активности. Чаще стали выделяться фаги, способные лизировать большое число штаммов одного подвида или даже штаммы разных подвидов. Особенно это характерно для сыродельных заводов.

По распространенности на первом месте стоят бактериофаги лактококков – лактококкофаги, на втором – фаги термофильного стрептококка. Фаги термофильных лактобацилл на заводах встречаются сравнительно реже. Тем не менее, они также наносят ущерб качеству крупных сыров и других молочных продуктов, вырабатываемых с участием лактобацилл. Впервые специфические для L. helveticus фаги выделены в Финляндии при производстве Эмменталя и описаны в 1955 г. Изучение вирулентного и умеренного фагов этого вида показало, что они имеют изометрическую головку размером 53 нм, сокращающийся чехол длиной 150 нм, что свойственно фагам группы А по Бредли, продолжительность латентного периода 2 и 4 ч, выход фага 300 и 100 частиц. Авторы предполагают, что источником фагов термофильных лактобацилл в сыроделии являются лизогенные штаммы [466].

В Финляндии выделен фаг Lbc. lactis LL-K, который был причиной снижения качества крупных сыров. Продолжительность латентного периода его на L. lactis LL-23, применяемой в производстве сыров группы Швейцарского, равнялась 150–180 мин, выход 250–300 частиц, головка изометрическая, отросток длиной 170 нм и диаметром 7 нм. Kunz et al. выделили два фага термофильных лактобацилл с размерами головки 64–76 нм и длиной отростка 256–366 нм. Sozzi et al. отмечают морфологическое разнообразие бактериофагов лактобацилл. Всего идентифицировано 6 основных морфологически различных типов бактериофагов (Bradley,1967):

А – фаги с сокращающимся отростком, содержащие двунитевую ДНК;

В – фаги с длинным несокращающимся отростком, содержащие двунитевую ДНК;

С – фаги с коротким несокращающимся отростком, содержащие двунитевую ДНК;

D – фаги без отростка, с большим капсидом, содержащие однонитевую ДНК;

Е – фаги без отростка, с маленьким капсидом, содержащие однонитевую ДНК;

F – нитевидные фаги, содержащие однонитевую ДНК;

По дополнительной классификации для фагов морфотипов А, В, С (Ackermann, H.-W., 1996) фаги А1, В1 и С1 имеют изометрическую головку, а фаги А2, В2 и С2 – головки удлиненной (пролатной) формы.

Наиболее часто встречаются 2 типа лактококкофагов [356, 359, 696]:

- с маленькой изометрической головкой, морфотип В2 (тип Р008) (рис. 1.13 и 1.15);

- фаги с пролатной (вытянутой) головкой, морфотип В1 (тип Р001) (рис. 1.14);

Реже встречаются фаги, характеризующиеся морфологическим разнообразием, касающимся воротничка, базальной пластинки, отростка. В России более распространены фаги В2, за рубежом – B1 [356, 359]:

Р и с. 1.13.Фаги морфотипа В1 коллекции с изометрическим капидом из ВНИИМС, статистически достоверно различаются по морфометрическим показателям, что позволило выделить 4 морфогруппы	Р и с. 1.14.Фаг P00l морфотипа В1 из коллекции Тойбер, Германия	Р и с. 1.15.Фаг Р008 морфотипа В2 (справа) из коллекции Тойбер, Германия (рядом фаг Т4)

Лактококкофаги морфотипа В2 более морфометрически однородны и схожи с фагом Р008 из коллекции Тойбер. Фаги термофильного стрептококка исследованы весьма скудно. Они принадлежат к морфотипу В2, имеют изометрическую головку размером 49–60 нм, несокращающиеся отростки длиной 130–960 нм, диаметром 8–9 нм со щеткообразной пластинкой на конце или пластинки с нитями. Сведений о фагах, лизирующих бифидобактерии, нет.

В системе предупрежления фаголизиса заквасочной микрофлоры при производстве ферментированных продуктов с участием штаммов-пробиотиков важно предупредить фаголизис не только лактобацилл, но и лактококков и термофильного стрептококка, которые часто входят в состав закваски ПФП.

Созданная в результате многолетней совместной работы сотрудников ВНИИМС и Экспериментальной биофабрики, при нашем участии, систематическая коллекция бактериофагов, а также получение производственно-ценных заквасочных штаммов по модифицированной нами методике генетической рекомбинации (конъюгации) и разработанные «Методические указания по проведению фагового мониторинга на сыродельных предприятиях» – научный вклад в осущетвление реальных практических задач, стоящих перед производителями ферментированных молочных продуктов(Перфильев Г.Д., Сорокина Н.П., Протасова (Полянская) И.С., Ахвердян В.З. и др.):

- поддержание высокого уровня санитарии и гигиены как условие в борьбе с поражением молочнокислых бактерий бактериофагом;

- повышение устойчивости молочнокислых бактерий к фагам, имеющимся на заводе, путем отбора в состав БК фагоустойчивых штаммов и ротации заквасок.

Подобного рода коллекция бактериофагов является единственной в России и в настоящее время содержит более 380 вирионов фагов молочнокислых микроорганизмов, выделенных на предприятиях России, Белорусии, Казахстана и выделенные из субстратов (молочных продуктов, заквасок и бактериальных концентратов) дальнего зарубежья.