Методы выделения и очистки белков
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ
ТАМБОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
ИМЕНИ Г.Р. ДЕРЖАВИНА
А.В. Гулин
С.Е. Синютина
А.Г. Шубина
БИОХИМИЯ
(часть 1)
Допущено Редакционно-издательским
советом ТГУ имени Г.Р. Державина в качестве
учебного пособия для студентов,
обучающихся по специальностям
060101.65 – Лечебное дело
060103.65 – Педиатрия
060105.65 – Стоматология
Тамбов 2014
| УДК ББК Г |
Рецензенты:
Доктор медицинских наук, профессор С.Н. Симонов
Доктор биологических наук, профессор Е.В. Малышева
| С | Гулин, А.В. Биохимия (часть 1): Учебное пособие для студентов университетов, обучающихся по специальностям «Лечебное дело», «Педиатрия», «Стоматология» / А.В. Гулин, С.Е. Синютина, А.г. Шубина; Министерство образования и науки РФ, Тамб. гос. ун-т им. Г.Р. Державина, Тамбов: Издательский дом ТГУ им. Г.Р. Державина, 2014. - с. |
| УДК ББК © Тамбовский государственный университет им. Г.Р. Державина, 2014 |
СОдержАНИЕ
| С. | |
| Предмет биохимии | |
| 1. Химия белков | |
| 1.1. Методы выделения и очистки белков | |
| 1.2. Функции белков | |
| 1.3. Аминокислотный состав белков | |
| 1.4. Структурная организация белков | |
| 1.5. Физико-химические свойства белков | |
| 1.6. Классификация белков | |
| 1.6.1. Простые белки | |
| 1.6.2. Сложные белки | |
| 2. Ферменты | |
| 2.1. Химическая природа ферментов | |
| 2.2.Механизм действия ферментов | |
| 2.3. Кинетика ферментативных реакций | |
| 2.4. Свойства ферментов | |
| 2.5. Регуляция активности ферментов | |
| 2.6. Классификация и номенклатура ферментов | |
| 2.7. Ферменты в медицине | |
| 3. Витамины | |
| 3.1. Жирорастворимые витамины | |
| 3.2. Водорастворимые витамины | |
| 4. Основные принципы организации биомембран | |
| 4.1. Строение и функции мембран | |
| 4.2. Транспорт веществ через мембрану | |
| 5. Механизмы передачи гормонального сигнала | |
| 6. Введение в метаболизм | |
| 6.1. Общая схема катаболизма | |
| 6.2. Биоэнергетика | |
| 6.3. Организация и функционирование дыхательной цепи | |
| 6.4. Разобщение дыхания и фосфорилирования | |
| 6.5. Микросомальное окисление | |
| 6.6. Антиоксидантная система | |
| 6.7. Реакции общего пути катаболизма | |
| 6.7.1. Окислительное декарбоксилирование ПВК | |
| 6.7.2. Цикл трикарбоновых кислот | |
| 7. Обмен углеводов | |
| 7.1. Переваривание углеводов | |
| 7.2. Обмен гликогена | |
| 7.3. Гликолиз | |
| 7.4. Включение фруктозы и галактозы в гликолиз | |
| 7.5. Челночные механизмы | |
| 7.6. Цикл Кори | |
| 7.7. Спиртовое брожение | |
| 7.8. Пентозофосфатный путь превращения глюкозы | |
| 7.9. Глюконеогенез | |
| 7.10. Регуляция обмена углеводов | |
| 7.11. Нарушения углеводного обмена | |
| Литература |
ПРЕДМЕТ БИОХИМИИ
Биохимия– наука о химических основах процессов жизнедеятельности, изучающая химические компоненты живых клеток, а также реакции и процессы, в которых они участвуют. Предметом медицинской биохимии являются химические процессы, происходящие в организме человека в норме и при патологии.
Основная цель биохимии - изучение молекулярных основ физиологических функций человека в норме с учетом онтогенеза, молекулярных механизмов развития патологических процессов, предупреждения и лечения болезней, биохимических методов диагностики болезней и контроля состояния здоровья человека.
Ряд выдающихся открытий в биохимии и в некоторых ее разделах – энзимологии, биохимической генетике, молекулярной биологии, биоэнергетике и др., - выдвинули ее в раздел фундаментальных научных дисциплин, сделав орудием решения многих важных проблем биологии и медицины.
ХИМИЯ БЕЛКОВ
Белки - высокомолекулярные азотсодержащие органические вещества, молекулы которых построены из остатков аминокислот, соединенных пептидными связями. Белки называют также протеинами (от греч. рrotos – первый). Свое название они получили, когда в тканях животных и растений были обнаружены вещества, имеющие сходство с белком куриного яйца.
Белки составляют основу и структуры, и функций живых организмов. Природные белки построены из 20 различных аминокислот. Эти аминокислоты могут объединяться в самой разной последовательности, поэтому способны образовывать порядка 1018 разнообразных белков. Белки обеспечивают существование около 106 видов живых организмов, начиная от вирусов и заканчивая человеком. Каждый организм характеризуется уникальным набором белков.
Содержание белков в различных тканях одного организма неодинаково. Так, в организме человека содержится белков в % от сухой массы: в мышцах – 80, в мозге – 45, в костях – 20.
Элементный состав белков в пересчете на сухое вещество, %: С - 50-54; Н - 6,5-7,3; О - 21-23; N - 15-17; S - до 0,5. В составе некоторых белков в небольших количествах содержатся фосфор, железо, марганец, магний, йод и др. Содержание азота относительно постоянно во всех белках (около 16%), поэтому по белковому азоту можно определять количество белка в биологических объектах.
МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БЕЛКОВ
Белки под действием различных факторов (действие химических реагентов, нагревание и др.) легко подвергаются денатурации: происходит разрушение нативной структуры белков, приводящее к потере некоторых природных свойств, например, растворимости, биологической активности. Поэтому для выделения белков разработаны специальные «щадящие» методы.
Процесс начинают с гомогенизациибиологического материала – измельчения до разрушения клеточных структур. Для этого используют пестиковые или ножевых гомогенизаторы, шаровые мельницы, ультразвук, метод попеременного замораживания и оттаивания ткани, метод «азотной бомбы».
Затем проводят экстракцию белков буферными смесями с определенными значениями рН, органическими растворителями. Большинство белков хорошо растворимо в 8-10% растворах солей.
Для фракционированияи очистки белков используют следующие методы.
Высаливание – осаждение белков при добавлении растворов солей щелочных и щелочноземельных металлов. В клинической практике этот метод используют для разделения глобулинов (выпадают в осадок при 50% насыщении раствора сульфата аммония) и альбуминов (при 100% насыщении).
Электрофорез основан на различной подвижности белков в электрическом поле в зависимости от значений рН и ионной силы раствора. Применяется в клинической медицине для анализа белковых и пептидных смесей, сыворотки крови.
Ультрацентрифугирование - метод разделения жидких дисперсных сред на компоненты под действием центробежной силы.
Хроматография - физико-химический метод разделения и анализа смесей веществ, основанный на распределении их компонентов между двумя несмешивающимися фазами – неподвижной (сорбент) и подвижной (элюент). В клинических лабораториях хроматографию применяют для разделения и анализа аминокислот, белков, углеводов, фосфолипидов, стероидов в плазме крови, тканевых экстрактах, моче.
Различают следующие виды хроматографии:
- адсорбционная– компоненты смеси разделяются в зависимости от их сорбируемости на твердом адсорбенте;
- распределительная - твердая фаза является опорой для стационарной жидкой фазы (бумажная хроматография);
- ионообменная - используют ионообменную смолу, с функциональными группами которой обменивается и задерживается на колонке часть белков, в то время как другие белки беспрепятственно элюируются из колонки;
- гель-хроматография или метод молекулярных сит позволяет разделить белки с разной молекулярной массой: небольшие молекулы проникают в поры геля, тогда как большие молекулы остаются снаружи, двигаясь вместе с подвижной фазой через хроматографическую колонку.
Перспективными видами хроматографии являются высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и газовая хроматография.
ФУНКЦИИ БЕЛКОВ
Структурная функция. В комплексе с липидами белки участвуют в образовании биомембран клеток. Структурные белки цитоскелета придают форму клеткам и многим органоидам. Примерами структурных белков являются коллаген в соединительной ткани, кератин в волосах, ногтях, коже.
Сократительная (двигательная) функция.Сократительная функция присуща мышечным белкам (актин и миозин). Белки цитоскелета необходимы для расхождения хромосом в процессе митоза.
Питательная (резервная) функция. Белки яйца (овальбумины) - источники питания для плода. Основной белок молока (казеин) также выполняет питательную функцию.
Каталитическая функция. Большинство известных в настоящее время ферментов (биологических катализаторов) является белками.
Транспортная функция. Белок эритроцитов гемоглобин участвует в переносе кислорода и углекислого газа, выполняя дыхательную функцию. Альбумины сыворотки крови участвуют в транспорте липидов.
Защитная функция. В ответ на поступление в организм бактерий, токсинов, вирусов или чужеродных белков синтезируются защитные белки - антитела (иммунная защита). Ряд белков плазмы крови способны к свертыванию, что предохраняет от кровопотери при ранениях (физическая защита).
Гормональная функция. Группа гормонов представлена белками или полипептидами, например, гормон поджелудочной железы инсулин.
Рецепторная функция. Клеточные белки образуют специфические рецепторы и участвуют в передаче гормонального сигнала.
Другие важные функции белков - способность поддерживать онкотическое давление в клетках и крови, буферные свойства, обеспечивающие физиологическое значение рН внутренней среды, и др.