Клиническое значение определения активности липазы
Определение активности липазы в сыворотке и плазме крови, асцитической и плевральной жидкости используется исключительно для диагностики заболеваний поджелудочной железы, чаще всего панкреатита. Чувствительность и специфичность определения активности липазы для выявления панкреатита находятся в пределах от 60 до 100% и от 81 до 97% соответственно [4]. После развития острого панкреатита сывороточная активность липазы увеличивается через 4–8 ч, достигая пика активности к 24 ч, и уменьшается через 8–14 дней; повышенная активность сохраняется дольше, чем активность амилазы. Описано повышение активности от 2 до 50 раз выше верхнего референтного значения. Повышение активности липазы обычно параллельно повышению активности амилазы, но увеличение активности липазы может наблюдаться раньше и нормализоваться позднее, чем амилазы; активность липазы может повышаться значительнее. При остром панкреатите нормоамилаземия может встречаться с частотой до 20% случаев. Наличие липемии может привести к ложной нормоамилаземии, в связи с чем рекомендуют определять активность обоих ферментов. Активность липазы в сыворотке крови не всегда связана с тяжестью заболевания [20].
При остром панкреатите в брюшной или плевральной полости может накапливаться жидкость, в которой может выявляться активность липазы. Приблизительно у 50% больных с тяжелым острым панкреатитом образуются кисты. Их присутствие предполагают в тех случаях, когда не наблюдается клинического улучшения в течение недели после острого приступа. Приблизительно у 50% больных со сформировавшимися кистами выявляется постоянная активность амилазы в сыворотке крови; полагают, что определение активности липазы может также быть полезным в подобных случаях [12].
Острый панкреатит иногда трудно диагностировать. Его необходимо дифференцировать от других острых заболеваний брюшной полости со сходной клинической картиной, например, перфорации язвы желудка или двенадцатиперстной кишки, кишечной непроходимости, тромбоза мезентериальных сосудов и многих других. Повышение активности сывороточной липазы в этих случаях является более специфичным признаком, чем повышение активности амилазы, так как при многих из этих заболеваний увеличение активности липазы менее вероятно. Эти соображения справедливы в тех случаях, когда определение активности липазы проводят с использованием в качестве субстрата триглицеридов с жирными кислотами с длинной цепью [32]. Определение активности липазы в сыворотке крови может представлять интерес при диагностике хронического панкреатита, когда разрушение значительной части ткани поджелудочной железы в далеко зашедших стадиях заболевания приводит к уменьшению количества фермента, поступающего в кровоток, и снижению активности в сыворотке крови. Умеренное повышение или отсутствие увеличения активности сывороточной липазы не является необычным для этого заболевания. Сдавление панкреатического протока конкрементом или опухолью поджелудочной железы может вызвать увеличение активности сывороточной липазы в зависимости от локализации процесса и количества функционирующей ткани железы [4].
При острых и хронических заболеваниях почек активность липазы в сыворотке крови увеличивается, хотя это повышение встречается не столь часто и менее выражено по сравнению с активностью амилазы [7]. В отличие от амилазы, которая находится и в поджелудочной железе, и в околоушных железах, в последних липаза отсутствует. При остром паротите без вовлечения поджелудочной железы активность липазы в сыворотке крови обычно не повышается, тогда как активность амилазы возрастает. Исследование желчевыводящих путей с помощью эндоскопической ретроградной панкреатографии, лечение опиатами, вызывающими спазм сфинктера Одди, может вызвать повышение активности липазы в сыворотке крови [26].
Методы определения активности липазы в сыворотке крови
Титриметрические методы
Титриметрические методы для определения активности липазы в крови были первыми методами, которые стали использовать в практических лабораториях. Метод, предложенный I. Cherry и I. Crandall, ставший позднее классическим, был основан на количественном определении жирных кислот, высвободившихся после инкубации образца сыворотки в течение 24 ч при 37 °C с 50% эмульсией оливкового масла в фосфатном буферном растворе при pH 7,0, титрованием 0,05 н. раствором NaOH с фенолфталеином в качестве индикатора [27].
Титриметрические методы вскоре были вытеснены методами, основанными на измерении величины рН инкубационной среды после завершения реакции. Позднее измерение pH стали проводить в варианте метода непрерывной регистрации с использованием чувствительного pH-метра, позволяющего при нормальной активности фермента фиксировать изменения pH инкубационной среды менее 0,02 ед. В данной процедуре использовали в качестве субстрата оливковое масло без добавления желчных кислот или колипазы. Поскольку реакция протекает достаточно быстро, для большинства образцов сыворотки достаточно 3-минутной инкубации [28].
Высокая чувствительность методов непрерывной регистрации, основанных на рН-метрии, позволила укоротить инкубационный период и снизить возможность инактивации фермента в течение инкубационного периода. Метод, предложенный Tietz и Repique в 1973 г., позднее ими же модифицированный, основан на поддержании значения рН среды инкубации в пределах 9,0 при 30 °С путем добавления титрованного раствора NaOH. Количество использованной щелочи, отнесенное ко времени, использовалось для расчета активности липазы. Была достигнута достаточная точность при использовании 100 мкл сыворотки крови при коротком времени реакции — от 3 до 8 мин. При использовании в качестве субстрата оливкового масла при 30 °С верхние значения референтного интервала были ниже 235 ед./л; с триолеином в качестве субстрата были получены несколько более высокие значения, верхний предел референтного интервала составлял 258 ед./л [29]. По мнению многих авторов, методы определения активности липазы в сыворотке крови, основанные на pH-метрии, являются точными, быстрыми и простыми в исполнении и могут считаться в настоящее время своеобразным золотым стандартом, с которым необходимо сравнивать все другие методы определения активности липазы. Увеличение концентрации колипазы и желчных солей, режим непрерывной регистрации привели к повышению воспроизводимости метода [28].
Турбидиметрические методы
Эмульсия липидов в воде имеет «молочный» внешний вид, так как мицеллы поглощают и рассеивают падающий свет. По мере гидролиза триглицеридов происходит просветление эмульсии, поскольку нарушается мицеллярное строение частиц. Приготовление и сохранение устойчивых и стабильных субстратов с соответствующими параметрами является достаточно сложной задачей; высокая исходная величина поглощения может приводить к значительной аналитической ошибке. Несмотря на многие теоретические и практические возражения, турбидиметрические методы определения активности липазы пользуются популярностью, особенно после их оптимизации [31].
Недостаток турбидиметрического метода сводится к отсутствию линейности на ранней стадии реакции в некоторых образцах сыворотки крови пациентов с высокой концентрацией ревматоидного фактора.
Ферментативные методы
Были разработаны различные ферментативные методы определения активности липазы в сыворотке крови. В методе, разработанном компанией «Kodak», об активности липазы судят по количеству образующегося в реакции глицерина после гидролиза субстрата (стрелочка в низ) l-олеил-2,3-диацетилглицерина — под действием липазы и вспомогательного фермента — диацетиназы (реакции 1 и 2). В состав инкубационной среды включен эмульгатор — додецил-бензилсульфонат. В серии последующих реакций (3, 4) и при окислении красителя (триарилимидазол) перекисью водорода (5) в присутствии пероксидазы образуется окрашенный комплекс, величину поглощения определяют при 540 нм.
В связи с тем, что для определения активности липазы использован неоптимальный для липазы субстрат, в приведенном методе происходит определение вместе с панкреатической липазой карбоксиэстеразы и кишечных липаз [34]. Вначале для данного метода компания предложила референтный интервал от 23 до 208 ед./л при 37 °С, позднее был рекомендован верхний предел значений 300 ед./л, возможно, из-за недостаточной специфичности этого метода [35].