Тема: Методы количественного определения активности ферментов. Основные принципы энзимодиагностики и энзимотерапии

ЦЕЛЬ: Ознакомиться с принципами выделения ферментов и количественной оценки активности ферментов.

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ К ЗАНЯТИЮ

1. На регистрации каких явлений основано обнаружение ферментов?

2. На чём основано количественное определение ферментов?

3. Единицы измерения активности ферментов.

4. Различия ферментного состава органов и тканей. Понятие об органоспецифичности ферментов.

5. Принципы и последовательность действий при выделении ферментов из биологического материала.

6. Определение активности ферментов в сыворотке крови и других биологических жидкостях. Изменение активности сывороточных энзимов при заболеваниях. Принципы энзимодиагностики.

7. Основные направления энзимотерапии.

Изоферменты. Клиническое значение определения активности изоферментов на примере лактатдегидрогеназы и креатинфосфокиназы. Решите ситуационные задачи:

1. Поставьте предварительный диагноз по следующим данным анализа крови и мочи больного: активность амилазы, липазы, трипсина в крови и моче больного резко повышена.

2. В приёмное отделение больницы доставлен больной 45 лет с жалобами на острейшие боли в эпигастрии, тошноту, рвоту. При осмотре отмечена бледность кожи и слизистых, аритмичный пульс, снижено АД, аускультативно – глухость сердечных тонов. При лабораторном обследовании: общий анализ крови без воспалительных изменений; биохимический анализ крови – повышение активности АСТ и ЛДГ, при нормальных показателях АЛТ, амилазы, щелочной фосфатазы. Какое заболевание Вы заподозрили? Какие дополнительные ферментные тесты помогут Вам подтвердить диагноз?

3. При исследовании крови больного выявлена величина коэффициента Ритиса (АСТ : АЛТ), равная 0,46 (в норме – 1,33). О поражении какого органа свидетельствует выявленный показатель?

Основные разделы	Ферменты	Примеры использования
Диагностика	Лактатдегидрогеназа Изофермент ЛДГ1	Инфаркт миокарда
Аспартатаминотрансфераза АСТ	Инфаркт миокарда
Аланинаминотрансфераза АЛТ	Заболевания печени (например, вирусный гепатит)
Креатинкиназа КК Изофермент МВ	Инфаркт миокарда
Креатинкиназа КК Изофермент ММ	Прогрессирующая мышечная дистрофия
a-амилаза, липаза, трипсин	Заболевания поджелудочной железы
Кислая фосфатаза	Рак предстательной железы
Лечение	Пепсин	Нарушение переваривания белков в желудке. Нарушение синтеза или секреции пепсина
Трипсин, химотрипсин	Лечение гнойных ран
Стрептокиназа. урокиназа	Предотвращение тробмообразования при пересадке органов и других операциях
Аспарагиназа	Лечение онкологических заболеваний
Уреаза	Применение в аппаратах ‘‘искусственная печень’’ и ‘‘искусственная почка’’
Гиалуронидаза	Рассасывание рубцов
Использование в качестве аналитических реактивов	Глюкозооксидаза	Определение глюкозы в крови
Уреаза	Определение мочевины в крови

Таблица: ПРИМЕНЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ В МЕДИЦИНЕ

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА.

Количественное определение активности амилазы мочи (диастазы).

Принцип метода: Метод основан на определении времени, необходимого для полного расщепления определённого количества крахмала ферментом, присутствующим в моче. Условно за единицу активности амилазы мочи принимают количество фермента, расщепляющего 2 мг крахмала за 15 минут. Активность амилазы выражают количеством условных единиц в 1 мл мочи. В норме она составляет 1 – 2 ед.

Порядок выполнения работы: На сухую чашку Петри заранее наносят в разных местах по одной капле 0,1% раствора йода в йодиде калия (всего 10 - 15 капель). В сухую пробирку вносят 2 мл 0,1% раствора крахмала, содержащего 2 мг крахмала, 1 мл 0,85% раствора хлорида натрия, перемешивают и помещают пробирку в водяную баню при 37°С на две минуты. Через две минуты, не вынимая пробирку из бани, добавляют в неё 0,5 мл мочи, перемешивают и отмечают время начала реакции. Затем каждые две – три минуты, не вынимая пробирки из бани стеклянной палочкой переносят каплю смеси из пробирки на чашку Петри в каплю йода. Так продолжают до тех пор, пока окраска капли йода не перестанет

изменяться, т.е. до появления жёлтого цвета, и отмечают время реакции в минутах. Активность амилазы мочи рассчитывают по формуле:

,

где: X – активность амилазы в 1 мл мочи;

15 – время, необходимое для полного расщепления 2 мг крахмала (условная единица) мин.;

0,5 – количество мочи, взятое в реакционную смесь, мл;

Т – время реакции, мин.

Клинико-диагностическое значение. Гиперамилаземия и гиперамилазурия наиболее выражены при остром панкреатите, хотя отмечаются и при других поражениях этого органа. К гиперамилаземиям внепанкреатического происхождения относят поражение слюнных желёз, почечную недостаточность. При поражениях поджелудочной железы кроме α-амилазы повышается уровень панкреатической липазы, фосфолипазы А₂, трипсина.

ЛИТЕРАТУРА ДЛЯ ПОДГОТОВКИ К ЗАНЯТИЮ. Основная:

1. Берёзов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник. 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 2002, с. 126-129, 157-159, 163-168.
2. Биохимия: Учебник/Под ред. Е.С. Северина. –М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003, (Серия XXI век), с. 118-123.
3. Николаев А.Я. Биологическая химия. М.: Медицинское информационное агентство, 2001, с. 89-92.
4. Лекционный материал.

Дополнительная литература: