Кислотно-основные свойства аминокислот
α-Аминокислоты в силу своего химического строения проявляют кислотно-основные (амфотерные) свойства, которые определяют многие физико-химические и биологические свойства белков. На этих свойствах основаны, почти все методы выделения и идентификации аминокислот и белков.
При нейтральном значении рН аминокислоты в растворах находятся в виде биполярного иона (цвиттер-иона), при этом аминогруппа протонирована (-NH3+), а карбоксильная группа - диссоциирована (-СОО-):
![]() | (рН ≈7) |
Ионизация аминокислоты зависит от рН среды: в кислых растворах ионизирована аминогруппа, а в щелочных - карбоксильная группа:
![]() | ![]() |
(рН=1) | (рН=11) |
В кислой среде α-аминокислоты выступают как основания (по аминогруппе), а в щелочной - как кислоты (по карбоксильной группе). У некоторых аминокислот может ионизироваться также радикал (R), в связи, с чем все аминокислоты можно разделить на заряженные и незаряженные (при физиологическом значении рН=6,0 - 8,0) (см. табл. 4). В качестве примера первых можно привести аспарагиновую кислоту и лизин:
![]() | ![]() |
Аспарагиновая кислота (отрицательно заряженная кислота, проявляет кислотные свойства) | Лизин (положительно заряженная кислота, проявляет основные свойства) |
Если радикалы аминокислот нейтральные, то они не оказывают влияния на диссоциацию α-карбоксильной или α-аминогруппы, и величинырК (отрицательный логарифм, показывающий значение рН, при котором эти группы наполовину диссоциированы) остаются относительно постоянными.
Величины рК для α-карбоксилыюй (pK1) и α-аминогруппы (рК2) сильно различаются. При рН < pK1 почти все молекулы аминокислоты протежированы и заряжены положительно. Напротив, при рН > рК2 практически все молекулы аминокислоты являются отрицательно заряженными, так как α-карбоксильная группа находится в диссоциированном состоянии.
Следовательно, в зависимости от рН среды аминокислоты имеют суммарный нулевой положительный или отрицательный заряд. Значение рН, при котором суммарный заряд молекулы равен нулю, и она не перемещается в электрическом поле ни к катоду, ни к аноду, называется изоэлектрической точкой и обозначается pI.
Для нейтральных α-аминокислот значение pI находят как среднее арифметическое между двумя значениями рК:
При рН раствора меньше pI аминокислоты протонируются и, заряжаясь положительно, перемещаются в электрическом поле к катоду. Обратная картина наблюдается при рН > pI.
Для аминокислот, содержащих заряженные (кислотные или основные) радикалы, изоэлектрическая точка зависит от кислотности или основности этих радикалов и их рК (рК3). Значение pI для них находят по следующим формулам:
для кислых аминокислот:
для основных аминокислот:
В клетках и межклеточной жидкости организма человека и животных рН среды близко к нейтральному, поэтому основные аминокислоты (лизин, аргинин) имеют положительный заряд (катионы), кислые аминокислоты (аспарагиновая, глутаминовая) имеют отрицательный заряд (анионы), а остальные существуют в виде биполярного цвиттер-иона.
Стереохимия аминокислот
Важной особенностью белковых α-аминокислот является их оптическая активность. За исключением глицина все они построены асимметрично, в связи с чем, будучи растворены в воде или в соляной кислоте, способны вращать плоскость поляризации света. Аминокислоты существуют в виде пространственных изомеров, относящихся к D- или L-ряду. L- или D-конфигурация определяется типом строения соединения относительно асимметрического атома углерода (атом углерода, связанный с четырьмя различными атомами или группами атомов). В формулах асимметрический атом углерода обозначают звездочкой. На рис.3 показаны проекционные модели L- и D- конфигураций аминокислот, которые являются как бы зеркальным отображением друг друга. Все 18 оптически активных белковых аминокислот относятся к L -ряду. Однако в клетках многих микроорганизмов и в антибиотиках, продуцируемых некоторыми из них, обнаружены D-аминокислоты.
Рис. 3. Конфигурация L- и D- аминокислот
Строение белков
Исходя из результатов изучения продуктов гидролиза белков и выдвинутых А.Я. Данилевским идей о роли пептидных связей -CO-NH- в построении белковой молекулы, немецкий ученый Э.Фишер предложил в начале XX века пептидную теорию строения белков. Согласно этой теории, белки представляют собой линейные полимеры α-аминокислот, связанных пептиднойсвязью - полипептиды:
В каждом пептиде один концевой аминокислотный остаток имеет свободную α-аминогруппу (N-конец), а другой - свободную α-карбоксильную группу (С-конец). Структуру пептидов принято изображать, начиная с N-концевой аминокислоты. При этом аминокислотные остатки обозначаются символами. Например: Ala-Tyr-Leu-Ser-Tyr- •••-Cys. Этой записью обозначен пептид, в котором N-концевой α-аминокислотой является аланин, а С-концевой - цистеин. При чтении такой записи окончания названий всех кислот, кроме последних меняются на - "ил": аланил-тирозил-лейцил-серил-тирозил-••• -цистеин. Длина пептидной цепи в пептидах и белках, встречающихся в организме, колеблется от двух до сотен и тысяч аминокислотных остатков.
Для определения аминокислотного состава белки (пептиды) подвергают гидролизу:
В нейтральной среде эта реакция протекает очень медленно, но ускоряется в присутствии кислот или щелочей. Обычно гидролиз белков проводят в запаянной ампуле в 6М растворе соляной кислоты при 105 °С; в таких условиях полный распад происходит примерно за сутки. В некоторых случаях белок гидролизуют в более мягких условиях (при температуре 37-40 °С) под действием биологических катализаторов-ферментов в течение нескольких часов.
Затем аминокислоты гидролизата разделяют методом хроматографии на ионообменных смолах (сульфополистирольный катионит), выделяя отдельно фракцию каждой аминокислоты. Для вымывания аминокислот с ионнообменной колонки используют буферы с возрастающим значением рН. Первым снимается аспартат, имеющий кислотную боковую цепь; аргинин с основной боковой цепью вымывается последним. Последовательность снятия аминокислот с колонки определяют по профилю вымывания стандартных аминокислот. Фракционированные аминокислоты определяют по окраске, образующейся при нагревании с нингидрином:
В этой реакции бесцветный нингидрин превращается; в синефиолетовый продукт, интенсивность окраски которого (при 570 нм) пропорциональна количеству аминокислоты (только пролин дает желтое окрашивание). Измерив, интенсивность окрашивания, можно рассчитать концентрацию каждой аминокислоты в гидролизате и число остатков каждой из них в исследуемом белке.
В настоящее время такой анализ проводят с помощью автоматических приборов - аминокислотных анализаторов (см. ниже рис. Схемы прибора). Результат анализа прибор выдаёт в виде графика концентраций отдельных аминокислот. Этот метод нашел широкое применение в исследовании состава пищевых веществ , клинической практике; с его помощью за 2-3 часа можно получить полную картину качественного состава аминокислот продуктов и биологических жидкостей.
Рис. Схема аминокислотного анализатора: 1 - вымывающий раствор (буфер с переменным рН); 2 - хроматогрифическая колонка (в верхнюю часть колонки вносят гидролизат белка, затем начинают вымывание); 3 - раствор нингидрина; 4 - водяная баня (подогревание необходимо для ускорения реакции нингидрина с аминокислотами); 5 - спектрофотометр и записывающее устройство; 6 - хроматограмма, каждый пик которой соответствует одной аминокислоте, а площадь пика пропорциональна концентрации аминокислоты в гидролизате.