Техника приготовления микропрепаратов.

Макроскопический анализ

Макроскопический анализ является основным методом определения подлинности цельного сырья по внешним морфологическим признакам. При проведении этого анализа обращают внимание на 1) внешний вид сырья, 2) размеры, 3) цвет, 4) запах и 5) вкус.

1) Внешний вид сырья определяют невооруженным глазом или при помощи ручной лупы с десятикратным увеличением.

2) Размеры сырья определяют с помощью миллиметровой линейки или раскладывая сырье на миллиметровой бумаге. Для объективного суждения о размерах частей сырья необходимо провести несколько измерений, для более мелких объектов - до 10-20 измерений.

3) Цвет сырья определяют при дневном освещении. При этом отмечают его цвет с поверхности, а также в изломе или на разрезе.

4) Запах сырьяопределяют при растирании или разломе, твердые объекты скоблят скальпелем или растирают в ступке.

5) Вкус сырья определяют на последнем этапе анализа, когда выяснено, что анализируемое сырье не ядовито. Для этого, взяв в рот не большие кусочки сырья, осторожно жуют их, не проглатывая, и, определив вкус, выплевывают. Для ядовитых объектов вкус не определяется.

Характерные внешние признаки сырья изучают как на сухом материале, так и на размоченном или увлажненном.

Схемы для морфологического описания

лекарственного растительного сырья:

I. Листья /Folia/

1. Товарный вид сырья (полный лист или его части).

2. Тип листа (простой, сложный).

3. Размеры листовой пластинки.

4. Форма (очертания) листовой пластинки (линейный, округлый, яйцевидный и др.)

5. Характер края листовой пластинки.

6. Характер жилкования.

7. Наличие или отсутствие черешка.

8. Опушение.

9. Цвет.

10. Запах.

11. Вкус.

12. Специфические особенности.

II. Цветки /Flores/

1. Товарный вид сырья (соцветия или их части, отдельные цветки или их части).

2. Тип соцветия. Строение соцветия (наличие различных типов цветков в соцветии, их взаимное расположение).

3. Строение цветка (особенности околоцветника, характер андроцея и гинецея, положение завязи).

4. Размеры цветка или соцветия.

5. Наличие и длина цветоножек.

6. Наличие прицветных листьев (прицветников). Их форма и размер.

7. Опушение.

8. Цвет.

9. Запах.

10. Вкус.

III. Кора /Cortex/

1. Форма кусков коры: плоские, желобовидные, трубчатые, желобовидно перекрученные.

2. Размеры (длина, толщина).

3. Характер наружной поверхности (гладкая, шероховатая, характер чечевичек и т. д. ).

4. Характер излома: ровный, неровный, зернистый, волокнистый, занозистый, щетинистый.

5. Цвет (с наружной стороны, с внутренней стороны).

6. Запах при соскабливании.

7. Вкус.

IV. Плод /Fructus/

1. Товарный вид сырья: целые плоды или их части, соплодия.

2. Форма плода (соплодия).

3. Размеры (длина, ширина, толщина).

4. Наличие и размер плодоножек.

5. Характер поверхности кожуры (голая, опушенная, наличие ребрышек, остатки чашечки, прицветников и т. д.).

6. Количество косточек или семян, их форма, размер, окраска.

7. Цвет.

8. Запах.

9. Вкус.

V. Семя /Semen/

1. Форма.

2. Размеры.

3. Характер поверхности (гладкая, опушенная, ячеистая, голая, бугорчатая и т. д.)

4. Наличие рубчика (семяшва)

5. Форма, размеры и расположение зародыша на поперечном срезе.

6. Цвет.

7. Запах.

8. Вкус.

VI. Трава /Herbaе/

1. Товарный вид сырья (цельное, обмолоченное, цветоносные верхушки и др.)

2. Стебель: форма, характер ветвления, размер (длина, толщина, травянистый или деревянистый).

3. Листорасположение, характер прикрепления к стеблю.

4. Листья: форма, размер, жилкование, край листовой пластинки.

5. Тип соцветия, строение цветка, размеры.

6. Строение и форма плодов, их размеры.

7. Характер опушения.

8. Цвет.

9. Запах.

10. Вкус.

VII. Корни /Radices/, корневища /Risomata/, корневище и корень / Risomata et radices/, корневища с корнями /Risomata cum radicibus/, луковицы /Bulbi/, клубни /Tubera/, клубнелуковицы /Bulbotubera/.

1. Товарный вид сырья (корень, корневище, корневище и корень, столоны и т.д.; цельное, резаное, очищенное, неочищенное).

2. Форма

3. Размеры (длина, ширина, толщина)

4. Характер поверхности (наличие продольных и поперечных складок, рубцов от листьев, стеблей, корней)

5. Характер излома (ровный, неровный, волокнистый, щетинистый, занозисто-деревянистый, зернистый)

6. Цвет снаружи

7. Цвет на свежем изломе

8. Запах

9. Вкус

Микроскопический анализ.

Микроскопический анализ основан на определении признаков анатомического строения. Цель анализа – установление подлинности сырья. Для этого в общей картине анатомического строения различных органов и тканей отыскивают характерные диагностические признаки, по которым изучаемый объект можно отличить от других. При проведении этого анализа рассматриваемый объект помещают на предметное стекло в капле жидкости, накрывают покровным стеклом и рассматривают сначала при малом, а затем при большом увеличении микроскопа.

Техника приготовления микропрепаратов.

Приготовление препарата зависит от морфологической группы сырья и его состояния – цельное, резаное, порошкообразное.

Листья. Из тонких листьев готовят поверхностные микропрепараты. При исследовании цельного сырья берут кусочки пластинки листа с краем и жилкой, мелкие листья берут целиком.

Несколько кусочков сырья помещают в фарфоровую чашку, прибавляют 5% раствор едкого натра, разведенный водой (1:1), и кипятят в течение одной - двух минут. Затем содержимое выливают в чашку Петри, жидкость сливают, а сырье тщательно промывают водой. Из воды сырье вынимают скальпелем или препаровальной иглой, помещают на предметное стекло, убирают остатки воды фильтровальной бумагой и наносят каплю раствора хлоралгидрата или глицерина. После этого кусочек сырья разделяют скальпелем или препаровальной иглой на две части, одну из них осторожно переворачивают. Объект накрывают покровным стеклом, слегка подогревают до удаления пузырьков воздуха и, после охлаждения, рассматривают лист с обеих сторон под микроскопом.

При исследовании толстых кожистых листьев готовят поперечные срезы. Для этого сухие листья размачивают в воде, затем помещают в смесь воды, спирта и глицерина (1:1:1). Из размягченного листа делают поперечные срезы. Для размягчения сухих листьев их также можно прокипятить в воде в течение 10-20 минут.

При исследовании резаного сырья микропрепараты готовятся такими же способами.

При исследовании порошков листьев на предметное стекло наносят 2-3 капли хлоралгидрата, в них помещают небольшое количество исследуемого порошка, размешивают препаровальной иглой порошок, накрывают покровным стеклом и подогревают 2-3 минуты для просветления тканей листа. Для просветления также можно взять 3% раствор NaOH. При нагревании надо следить, чтобы препарат не высох. После нагревания покровное стекло слегка потирают о предметное, чтобы частицы порошка легли более тонким слоем, не накрывая друг друга. Если в качестве просветляющей жидкости использовался NaOH, добавляют 1-2 капли глицерина, нанося их рядом с покровным стеклом, так чтобы глицерин затянуло под покровное стекло.

Цветки.Для приготовления микропрепаратов из цветков и соцветий исследуемый материал предварительно кипятят в воде в течение 2-3 минут (иногда для этого используют 2-3% раствор NaOH, в этом случае после кипячения материал тщательно промывают водой). Отдельные цветки или их части помещают на предметное стекло в каплю включающей жидкости, накрывают покровным стеклом и рассматривают препарат с поверхности.

Трава.Определение трав ведется главным образом по листьям, поэтому для микроскопического анализа чаще всего используют листья. Приготовление препарата см. выше.

При исследовании безлистных трав готовят препараты эпидермиса стебля и поперечные срезы. Эпидермис снимают скальпелем после предварительного кипячения в 5% растворе NaOH, разбавленном водой (1:1). Для приготовления поперечных срезов стебли предварительно размягчают (методы размягчения такие же, как и для листьев).

При исследовании резаных трав выбирают наиболее крупные кусочки листьев и стеблей. Из стеблей иногда готовят «давленые» препараты. Для этого кусочки стеблей разваривают в 3-5% растворе NaOH для мягкости и раздавливают скальпелем на предметном стекле. Полученную массу помещают в глицерин или хлоралгидрат и накрывают покровным стеклом. Микроскопическая картина таких препаратов напоминает продольные срезы.

Из порошков трав микропрепараты готовят также как из порошков листьев.

Подземные органы.Для микроскопического анализа подземных органов обычно готовят препараты поперечных срезов, реже продольных. Предварительно корни, корневища или другие подземные органы размачивают. Для этого небольшие куски корня или другого подземного органа помещают в холодную воду и выдерживают около суток, затем переносят в смесь спирта с глицерином (1:1) на 3 - 5 суток. Поперечные срезы тонких корней должны пройти через весь поперечник корня, для более толстых корней, корневищ и других подземных органов достаточно сделать срез части поперечного сечения, но в нем обязательно должны быть представлены все ткани, начиная с пробки (эпидермиса) и кончая центральной частью. Общую картину строения изучают, рассматривая препарат при малом увеличении, детали структуры - при большом.

Резаное и дробленое сырье. Кусочки корней и корневищ кипятят в растворе 3-5 % щелочи (или воды). Затем расщепляют иглами или скальпелем (желательно в радиальном направлении) и рассматривают препараты в хлоралгидрате («давленый» препарат). Для выявления характера расположения проводящей системы у крупных кусочков корней и корневищ скальпелем выравнивают излом, смачивают его спиртовым раствором флороглюцина и наносят одну каплю концентрированной соляной кислоты. Элементы ксилемы окрашиваются при этом в малиново-красный цвет. В «давленых» препаратах при определении имеет большое значение вторичное утолщение стенок древесных сосудов; из механических элементов встречаются волокна, реже каменистые клетки и слабо утолщенные клетки эндодермы. В паренхиме часто содержатся кристаллы оксалата кальция. Иногда встречаются секреторные ходы и млечники.

Порошок. Небольшое количество порошка (на кончике иглы) вносят в каплю хлоралгидрата на предметном стекле, размешивают иглой до равномерной взвеси, накрывают покровным стеклом и рассматривают строение крахмальных зерен; затем препарат подогревают и изучают строение других анатомических элементов. Микроскопическое определение порошкованного сырья основано на анатомическом строении тканей и характерных включений в клетках (кристаллы, крахмал, инулин, слизь).

Важное место в диагностике резаного и порошкованного сырья занимают микрохимические реакции.

Кора. Для микроскопического исследования коры обычно готовят поперечные срезы, реже – продольные. Предварительно кусочки размягчают в воде, затем переносят в смесь вода-глицерин-спирт (1:1:1). Для размягчения цельного сырья его также можно прокипятить в воде в течение 5 -10 минут. Размягченные куски коры выравнивают лезвием или скальпелем, придавая поверхности среза строго перпендикулярное или продольное направление. Срезы готовят бритвой или бритвенным лезвием. Полученные срезы помещают в раствор хлоралгидрата или глицерина и нагревают для просветления и удаления воздуха. При необходимости препараты окрашивают для выявления различных структур или веществ.

Изучая поперечные срезы, обращают внимание на толщину и характер строения пробки, на наличие колленхимы, на соотношение толщины первичной и вторичной коры, ширину сердцевинных лучей. Важное значение имеют также лубяные волокна и каменистые клетки, их строение, расположение и количество.

Строение и размер волокон лучше видно на продольных срезах. Кроме того в коре некоторых растений имеются млечники или вместилища с эфирными маслами. Почти всегда имеются кристаллы оксалата кальция.

Порошки коры характеризуются отсутствием элементов ксилемы и определяются главным образом по механическим элементам, которые встречаются здесь в виде отдельных клеток или лежат группами или пучками. Большое значение при микроскопии порошков имеют также кристаллы оксалата кальция, обрывки пробки (особенно если она имеет характерный цвет).

Плоды, семена. Для микроскопического исследования плодов и семян готовят поверхностные препараты и поперечные срезы.

Для приготовления препаратов кожуры и околоплодника с поверхности 2-3 семени или плода кипятят в растворе 5% NaOH в течение 2-3 минут, после чего промывают их водой. Объект помещают на предметное стекло, препаровальными иглами отделяют кожуру семени или ткани оклоплодника и рассматривают их в растворе хлоралгидрата или глицерина.

Для приготовления срезов сухие плоды и семена предварительно размягчают, поместив их на сутки во влажную камеру (эксикатор с водой в которую добавлено несколько капель хлороформа) или водяным паром в течение 15-30 мин или более в зависимости от твердости объекта.

Мелкие плоды и семена помещают в парафиновый блок размером 0,5х0,5х1,5 см. Парафин расплавляют с узкой стороны блока кончиком нагретой препаровальной иглы и в образовавшуюся ямку погружают семя или плод, которые должны быть сухими. Срезы делают бритвой через объекты вместе с парафином. Из парафина срезы выбирают препаровальной иглой, смоченной жидкостью, окрашивают и готовят микропрепараты в растворе глицерина или хлоралгидрата.

Препараты порошков плодов и семян готовят так же, как это описано в разделе листья. В качестве просветляющей жидкости используют раствор хлоралгидрата или 5% раствор NaOH.