Определение активности каталазы по А. Н. Баху и А.И. Опарину

Принцип метода основан на учете изменения количества пероксида водорода, расщепляющегося под действием этого фермента, который определяется путем титрования перманганатом калия. Реакция идет по уравнению:

2 КМnО₄ + 5 Н₂О₂ + Н₂SО₄ ¾® 4 КНSО₄ + 2 МnSО₄ + 8 Н₂О + 5О₂

О количестве перекиси водорода, разрушенной ферментом, судят по разности количеств мл 0,1 н. раствора КМnО₄, израсходованных для титрования в контрольном и рабочем опытах.

Ход работы. Отбирают две пробы прозрачного фильтрата или центрифугата по 20 мл каждая ( опытная и контрольная); последнюю кипятят 5 минут на сетке для инактивации фермента.

К пробам прибавляют по 20 мл дистиллированной воды, по 3 мл 1%–го пероксида водорода, предварительно нейтрализованного 0,1 н. раствором NаОН, и оставляют на 30 минут при комнатной температуре. Затем к пробам прибавляют по 5 мл 10% –ной серной кислоты и оставшийся пероксид водорода титруют 0,1 н. раствором марганцовокислого калия. Об активности каталазы судят по количеству миллиграммов перекиси водорода, которое разрушилось в течение 30 минут ферментом, содержащимся в 1 г исследуемого материала.

Активность каталазы Е_к определяют по формуле:

(Vk - Vo) ^. 1,7

Е_k = ¾¾¾¾¾¾ , (2)

n

где Ек – активность каталазы;

Vk – количество 0,1 н. раствора КМnО4, израсходованного для титрования контроля, мл;

Vo – количество 0,1 н. раствора КМnО4, израсходованного на титрование рабочего опыта, мл (1 мл 0,1 н. раствора КМnО₄ эквивалентен 1,7 мг Н₂О₂);

n – навеска исследуемого материала в титруемой пробе, г.

Материалы и реактивы: 1%–ный раствор пероксида водорода; 0,1 н. раствор марганцовокислого калия; 10 %–ный раствор серной кислоты; вытяжка из муки или другого растительного материала (см. Приложение В, п.8).

Пероксидаза (1.11.1.7)

Пероксидаза - это двухкомпонентный фермент состоящий из гема и гликопротеида. Она катализирует реакцию:

RООН + АН₂ ¾¾¾¾> Н₂О + RОН + А,

где в качестве RООН могут быть Н₂О₂ или органические пероксиды, т.е. она высокоспецифична в отношении акцептора водорода и совсем не специфична в отношении донора водорода (ими могут служить фенолы, амины и другие органические соединения, т.е. обладает широкой субстратной специфичностью).

Механизм действия пероксидазы можно представить следующим образом:

Пер(ОН) + Н₂О₂ Пер (ООН) + Н₂О

Пер(ООН) + АН₂ Пер (ОН) + Н₂О +А

Пероксидаза с пероксидом водорода образует промежуточное комплексное соединение, в результате чего пероксид активируется и действует как акцептор водорода.

Действие пероксидазы может быть желательным при ферментации чая и табака, т. к. наряду с полифенолоксидазой она способствует образованию окрашенных и ароматизированных компонентов. В некоторых случаях действие пероксидазы нежелательно - так, для увеличения лежкости и сохранности перерабатываемых продуктов необходимо удалить или ингибировать пероксидазу вместе с полифенолоксидазой. Наиболее активна пероксидаза из корней хрена.