Ферменттік катализдің теориялық негіздері

Ферменттер басқа да катализаторлар (бейорганикалық) тәрізді тер­модинамикалық тұрғыдан жүруі мүмкін емес реакцияны жүргізбейді. Тек, жүре алатын реакцияның жылдамдығын ғана жоғарлатады. Кез келген химиялық реакцияның жүру мүмкіндігі оның реакция өнімдер­інің энергиясының реакцияласушы заттардың энергиясынан төмен немесе бірдей болғанында ғана өтеді. Реакция қашанда бос энергияның төмендеуі бағытына қарай жүреді, сондықтан реакция тепе-теңдігі өнімдер түзілуіне сәйкес ығысады. Бірақ, кез келген реакция басталуы үшін оның кедергі энергиясын, активтеуші энергияны қосу арқылы жеңуі қажет. Себебі реакция жүргенде кедергі энергиясының энергия­лық қоры артық аздаған молекулалар ғана әсерлеседі. Бұл жағдайда реакция жылдамдығы да баяу болады.

Реакцияласушы заттардың көптеген молекулалары бір бірімен не­ғұрлым жиірек әсерлесетін болса ғана жылдамдық жоғарлауы мүмкін. Ол тек активтеуші энергия көмегімен активтелген молекулалар мөл­шерінің көбеюі нәтижесінде бола алады.

Екі заттың реакциясын байқағанда

АВ + CD ↔ AD + BC

реакция өнімдері (AD, BC) түзілуі үшін АВ және CD әсерлесуіне қажет а-ға тең (активтендіруші энергия) энергияны қосымша алуы қажет. Ал реакция кері бағытта жүре­тін болуы үшін б-ға тең шамадағы көп мөлшерде энергия қажет. Сол себепті кері бағытта жүретін реакцияның активтендіру­ші энергиясы (Е_а) жоғары болады. Бұл жағ­дайда екі реакция үшін де бірдей өзгеретін бос энергияның шамасын в-кесіндісі көрсетеді. Солдан оңға қарай өтетін реакция экзотермиялық, ал кері бағыттағы реакция эндотермиялық болады. Сондықтан реакцияларды эндергоникалық (энергияны қабылдап жүретін реакция) және экзергоникалық (энергия бөліп жүретін реакция) реакцияларға бөледі. Реакция жүргенде энергияның жылу түрінде бөлінуі немесе қосып алуы міндетті емес.

Реакция жылдамдығының жоғарлауы катализатордың Е_а-ны (кедері энергиясын) төмендетуі арқылы өтеді. Ол суретте үзікті сызықпен көрсетілген. Мысалы, сутегі асқын тотығын (Н₂О₂) сутегі мен оттегіге бөлу үшін (Н₂О₂ → Н₂↑ + О₂↑) Е_а = 75,2 кДж/моль қажет. Коллоидтық пласты катализатор ретінде қолданғанда Е_а = 50,2 кДж/моль, ал биокатализатор каталаза қатысқанда Е_а = 8,3 кДж/моль қажет болады.

Биокатализатор-ферменттің жылдамдығын жоғарлатуы немесе Е_а-ны төмендеуі көп этапты механизм арқылы іске асады.

Сур. 6. Фермент пен субстраттың әсерлесу механизмі (Михаэлис-Ментен).

Ферментативті реакцияның жүруін жалпы түрде үш этапқа бөледі.

немесе фермент + субстрат ↔ фермент-субстраттық комплекс →
→ өнім + фермент.

Бұл реакция теңдеуінде (Михаэлис-Ментен теңдеуі) шешуші рольді фермент пен субстраттың қосылуынан түзілген фермент-суб­страттық комплекс атқарады. Ферменттің әсерлесу спецификасына тәуелді өтетін бұл қосылыс белгілі бір байланыстардың әлсізденіп бір мезгілде субстрат активтелінуі мен реакцияласушы қабілетінің жоғар­лауына әкеледі. Фермент-субстраттық комплексте бір мезгілде екі процесс өтеді: алғашқыда, комплекстің электрондар тығыздығының өзгеруі нәтижесінде ондағы байланыстардың полярлануы және соңынан субстрат молекуласындағы және активтік орталықтағы кейбір байланыс­тардың геометриялық деформациясы. Мо­ле­ку­ла­лар­да­ғы химиялық байланыстардың деформациясы мен полярлануы фермент-субстрат комлексінің аралық қалпындағы кедергіні (активтеуші энергияны (Е_а)) жеңуді қамтамассыз етеді. Ферментативтік катализдің бірінші этапында фермент пен субстраттың бір бірмен ковалентті немесе басқа түрлі байланысуы өтеді. Екінші этапта субстрат оған байланысқан ферменттің әсерінен химиялық өзгерістерге түседі. Соның нәтижесінде фермент-өнім комплексі пайда болады. Үшінші этапта фермент-өнім комплексі бөлініп фермент және өнімге ажыратылады. (Осы тараудағы активтік, жанастырушы, аллостерлік оралықтар тақырыбын қараңыз).

Қысқа уақытта «өмір сүріп», жылдам арада құрам бөліктеріне ажырайтын фермент-субстрат комплексі туралы түсінік 1913 ж. Михаэлис пен оның шәкірті Ментеннің ферментативті реакциялардың кинетикасына анализ жасауы нәтижесінде дамытылды және кейін Михаэлис-Ментен теориясы деп аталды. Бұл теория бойынша жоғарыда келтірілген схема ферментаттік процесстің үдеуі, энергетикалық тұрғыдан, реакцияның кедергі энергиясын тұрақсыз фермент-субстрат комплексі түзілуі көмегімен «айналып» өтуі арқылы іске асады. Комплекстің түзілуінде және ыдырауында аралық реакциялардың энергиясын негізгі реакцияға қараған­да төмендеу кедергілік энергияда болады.

Қайтымды реакция жүргенде ферментпен (Е) субстрат (S) (реакциялар жылдамдығы тұрақтысы k₁ және k₂) комплекс (ES) түзеді. Комплекс (ES) фермент пен өнімге реакция жылдамдығы тұрақтысы k_S бойынша ыдырайды. Комплекс (ES) диссоциациалануы мүмкін бол­ғандықтан оның диссоциация тұрақтысы (k_S = k₂ / k₁) теңдеуі бойынша есептеледі. Егер комплекстің диссоциация тұрақтысы жоғары болса қайтымды реакцияның k₂-сінің мәні де жоғары, ал k₁ мәні төмен болады. Сондықтан комплекс алғашқы қосылыстарға жеңіл бөлінеді де реакция баяу жүреді. Егер, керісінше k₁ мәні жоғары болса, k_S пен k₂ мәңдері төмен сол себепті кері бағыттағы реакцияның жүруі бәсеңдей­ді, диссоциация төмендейді, ал ферменттік реакция тікелей бағытта жылдам жүреді.

Массалардың әсерлесу заңы бойынша теңдеуді келесі түрде жазуға болады:

[S] · ([E₀] − [ES]) = k_S · [E·S]

[E₀] — реакция басталардағы ферменттің жалпы концентрациясы, [ES] — фермент-субстрат комплексі концентрациясы. [E₀] − [ES] — бастапқы фермент концентрациясынан фермент-субстрат комплексі концентрациясын алғандағы фермент концентрациясы.

Теңдеуді ары қарай ықшамдағанда, келесі түрге келеді:

.

Келтірілген теңдеуге сәйкес, егер [ES] концентрациясы неғұрлым көп болса ферменттік реакция жылдамдығы да жоғары болады. Ал, жылдамдық максимумы тек [ES] концентрациясы фермент концентрациясына теңескенде ғана немесе [ES] = [E₀] барлық фермент фермент-субстрат қосылысына түзілгенде жетеді. Реакция жылдамдығының максимумдық жылдамдыққа қатынасы келесі түрде беріледі:

Бұл теңдеуді жоғарыда келтірілген теңдеумен қосып ықшамдап келесі өрнекті алуға болады:

немесе

Теңдеу Михаэлис-Ментен теңдеуі деп аталады.

Теңдеудің шешімі келесі жағдай­ды түсіндіре алады. Егер [S] мәні K_S-ке қарағанда үлкен болса (сахарозаны β-фруктофуранозидазамен гидролиздегенде K_S = 0,0167 М) реакция жыл­дамдығы жылдамдық максимуміне тең болады (v = v_max).

Михаэлис-Ментен реакция жыл­дам­дылығы мен субстрат концентрациясы арасындағы тәуелділікті β-фруктофуранозидаза әсерінен сахароза, глюкоза, фруктоза ыдырауларын (сур.7) график түрінде көрсетті. Суреттегі қисық сызық бойынша реакция алғашқыда нольдік ретте жүрсе, соңынан бірінші ретпен жүретіндігі байқалады.

Соның негізінде ферменттік реакцияның толық жалпы жылдам­дығын келесі теңдеу арқылы есептеуге болады.

v = K_m · [ES], K_m — Михаэлис тұрақтысы (K_m = K₃ / K₄).

Михаэлис тұрақтысының өлшем бірлігі моль/л тең. Егер реакция жыл­дамдығы жылдамдық максимумының жартысына тең болса (v = ½v_max) Михаэлис тұрақтысы субстрат концентрациясына тең болады (K_m = [S]). Михаэлис тұрақтысы (K_m) қашанда диссоциация тұрақтысынан (K_S) бірнеше есе жоғары болады (мысалы, алкогольдегидрогеназаның K_S = 10⁻⁷ моль/л, ал K_m = 10^-3 моль/л). Сондықтан, ферментативті реакциялардың жылдамдығы басқа реакцияларға қарағанда өте жоғары, себебі, көптеген заттар үшін K_S = 10^-2—10^-7 аралығында болады. Михаэлис-Ментен теңдеуін ары қарай Лайнуивер мен Берк, Холдейн-Бриггс дамытты.

Ферменттердің әсерлесуінің ерекшеліктері. Ферменттердің бей­органикалық катализаторлардан өзгешелігі олардың өте нәзік маман­дандырылған әсер ету ерекшелігіне қабілеттілігі. Олар қатаң түрде белгілі бір реакцияларды катализдейді. Тек осы қасиеті арқылы ғана жекеленген ферменттік реакциялардың бір бірмен тығыз байланысты болуы және қатаң түрде реттеліп жүруі сақталады. Бұл тірі торшалар мен ағзалардың өмір сүруі үшін қажетті, заттар алмасуларына қажетті әртүрлі биохимиялық реакциялардың бірігуі болып табылады.

Ферменттік реакция жүруі үшін фермент субстратқа әсер етуі қажет. Бұл тек фермент молекула­сындағы активті орталықтың құры­лымына жанасу, каталиттік орталықтың, ғана емес сонымен бірге субстраттың да химиялық құрылысының ерекше­ліктеріне байланысты болады. Фермент пен субстрат бір біріне сәйкес келуі қажет, немесе фермент өзі әсер ететін субстратты танып біледі. Бұл үшін фермент құрылымындағы жанастырушы орталықтың қызметі ерекше. Жанастырушы орталықтың көмегімен реакцияласушы зат-фер­мент-субстрат комплексі түзіледі.

Қазіргі кезде фермент пен суб­страттың әсерлесу ерекшелігінің механизміне екі гипотеза (Фишер және Кошленд) ұсынылған.

Фишердің гипотезасы бойынша, фермент өзі әсер ететін субстратқа кілттің құлыпқа сәйкес келуіндей жанасады. Әртүрлі гликозидтерді ферменттермен гидролиздеуді зерттеген жұмысында Э.Фишер «…хи­миялық әсерлесу атқарылуы үшін энзим мен глюкозид бірі біріне кілттің құрыпқа келгеніндей дәл келуі қажет» деп жазған.

Ол фермент геометриялық және химиялық тұрғыдан өте қатаң, тұрақты құрылымда болады деп қабылдаған. Бұл құрылымның сәл де болса өзгеруі кілттің өзгеруі тәрізді құлыпқа сәйкес келмей қалады.

Соңғы кездері қатаң немесе тұрақты мықты құрылымға қарама қарсы майысқақ, созылмалы құрылым туралы гипотеза (американдық ғалым Д.Кошленд) ұсынылды.

Кошленд гипотезасы бойынша, фермент молекуласының конформациясы жане оның активтік орталығы коэнзим мен субстрат әсерле­суіне байланысты өзгереді. Суретте жоғарғы бөлікте, субстрат молекуласына сәйкес бейімделіп фермент конформациясы өзгереді, активті орталықтағы қызметші топтар да сәйкестеніп жанасады. Сондықтан реакция өтеді.

Төменгі бөлікте, субстраттың геометриялық өлшемдері өте кіші болғандықтан ферменттің қызмет­ші топтары сәйкес келмегендіктен реакция жүрмейді. Кошленд гипотезасы бойынша фермент конфор­мациясының өзгеруіне байланысты, оның физика-химиялық қасиет­терінің де өзгеретіні эксперимент жүзінде бірнеше рет дәлелденді. Бауырдың алкогольдегидрогеназасы температура әсерінен жылдам денатурланады және инактивтеледі. Ал оның НАД⁺ немесе НАД·Н-пен, немесе олардың бәсекелесі (конкуренті) изомай қышқылының амиді (ИМҚА)-мен комплексі, немесе НАД·Н-ИМҚА комплексі белгілі жағдайда қыздырғанда денатурацияны тежейтіндігі байқалған. Бұл жұмыстар г.Теорель зерттеулерінде дәлелденді. Аталған қасиеттер химотрипсин ферментінде де байқалады.

Субстраттық әсерлесу ерекшеліктері. Субстраттық (талғамдылық) әсерлесу ерекшелігі — бұл фермент молекуласының бір субстратқа немесе химиялық байланыстары мен топтары ұқсас бірнеше субстраттар топтарына әсері етуі қабілеті. Ферменттердің субстраттық әсерлесу ерекшелігі (талғамдылығы) оның активті орталығының субстратпен комплементарлы болып келуіне тәуелді болады. Субстраттық талғамдылықты шартты түрде үш түрге бөледі:

1. Абсолюттік субстраттық әсерлесу ерекшелігі (талғамдылық) -бұл ферметтің тек белгілі бір ғана субстратқа әсер ету қабілеті. Мысалы, уреаза ферменті тек мочевинаның гидролиттік ыдырау реакциясын катализдейді, ал ұқсас құрылыстағы метилмочевинаға әсер етпейді:

Глюкокиназа ферменті гликолиттік ыдырау реакциясында тек глю­козаға әсер етеді.

2. Субстраттық стереохимиялық әсерлесу ерекшелігі (талғамдылық) — бұл фер­мент­тің тек бір ғана оптикалық (D немесе L), немесе, геометриялық (цис-, немесе тране-) изомерге әсер ету қабілеті. Мысалы, протеолиттік ферменттердің тек L-аминқышқылдардан түзілген пептидтерге әсер етуі немесе L-аминооксидаза мен D-аминооксидазаның әсер етуі, лактат­дегидро­геназаның тек L-сүт қышқылына әсер етіп, D-сүт қыш­қылына әсер етпеуі жатқызылады.

3. Субстраттық салыстырмалы әсерлесу ерекшелігі (талғамдылық) - бұл фер­мент­тің белгілі бір типтегі химиялық байланысы бар субстраттар топтарына әсер ету қабілеті. Мысалы, асқазан-ішек трактісі (АІТ) протеиназа­ларының әртүрлі белоктардың пептидтік байланыстарын ыдыратуы. Пепсин ферменті тирозин мен фенилаланиннің амин топтарымен тү­зілген пептидтік байланыстың үзілуін катализдейді. Жылу қанды жа­нуарлардың асқазанының шырынынан алынған (шошқа, бұқа, қой) пепсиндерінің әсерлері ұқсас, ал балық пепсині біршама өзгешелеу ерекшелік көрсететіні байқалған. Трипсин ферментінің ароматты ами­ноқышқыл­дармен түзілген пептидтік байланыстарды үзуі (карбоксилдік топтары жақын орналасқан).

Кейбір оксиредуктазалар электрон акцепторы ретінде екі кофакторды да НАД⁺, НАДФ⁺ қолданады. Бірақ, сүтқоректілердің май қыш­қылдарын немесе стероидтардың синтезін катализдейтін оксиредуктазалары тотықсыздандырғыш ретінде НАДФ·Н-ты, гликолиз, май қыш­қылдарының тотығуын катализдейтін немесе ыдырату процесс­теріне қатысатын ферменттер тотықтырғыш ретінде НАД⁺-ті жиірек қолдана­тыны байқалған.

Ферменттік әсерлесу ерекшелігі. Фер­мент­тер­дің әсеріндегі талғамдылығы — бұл бір субстратқа әртүрлі фер­мент­тер­дің әсер етіп әртүрлі тек өзіне ғана тән реакцияларды катализдеуге қабілеттілігі.

E1, E2, E3 — ферменттер P1, P2, P3 — өнімдер S — субстрат

Ферменттер (Е₁, Е₂, Е₃) тек өздеріне ғана тән әсерлесу талғамдылығына қабі­летті және олар бір ғана субстратқа (S) әсер етеді. Бірақ әрбір фермент тек бір ғана типтегі реакцияны жүртізеді. Бұл талғамдылықтың ерекшелігі фермент молекуласының каталиттік орталығындағы реакцияласушы топтардың қасиетіне (жай ферменттерде) және кофакторлардың химиялық қасиеттеріне (күрделі ферменттер) тығыз байланыстылы­ғында.