Методы количественного определения флавоноидов

В настоящее время все большее распространение получают различные физико-химические и спектральные методы анализа, которые имеют ряд существенных преимуществ в сравнении, например, с гравиметрическими и титрометрическими методами, а именно быстрота и точность определения, обнаружение даже незна­чительных количеств и, что особенно важно, возможность выделения отдельных флавоноидов из растительного сырья. К таким методам относятся ВЭЖХ, хрома-тоспектрофотометрия, спектрофотометрия, фотоэлектроколориметрия, денсито-метрия с использованием хроматографии на бумаге и в тонком (закрепленном и незакрепленном) слое сорбента. Если необходимо применить хроматоспектрофо-тометрический метод, то хроматография (БХ, ТСХ, колоночная) используется как для очистки, так и для разделения суммы флавоноидов на отдельные компоненты.

Особенно ценным методом, отвечающим параметрам валидации, является ВЭЖХ. Внедрению этого метода в фармакопейный анализ во многом способствовали работы академика РАМН, профессора А.П. Арзамасцева, профессора Н.А. Тюкавкиной, профессора Г.Г. Запесочной, профессора И.А. Самылиной.

3.4.1. Спектрофотометрический метод. Основан на определении оптической плотности раствора анализируемых веществ при определенной длине волны. Например, в случае плодов расторопши пятнистой, почек тополя используется прямая спектрофотометрия, но чаще всего из-за возможного вклада других ароматических веществ в оптическую плотность анализируемых растворов приходится прибегать к очистке суммы флавоноидов (без хроматографии) или к реакции комплексообразования. Для фармакопейного анализа обычно используют раствор алюминия хлорида (трава зверобоя продырявленного и др.).

Например, для флавонов и флавонолов, в частности, для рутина характерны два макисимума поглощения — коротковолновый (260 нм) и длинноволновый (362 нм), что может быть использовано не только с целью идентификации веществ, но в плане количественной оценки, особенно в условиях дифференциальной спектрофотометрии. При этом в присутствии А1С1₃ образуется батохромный сдвиг длинноволновой полосы с образованием максимума при длине волны 412 нм (аналитическая длина волны). Этот подход является одним из самых используемых при анализе ЛРС, содержащего флавоноиды, поскольку позволяет минимизировать вклад сопуствующих веществ в оптическую плотность исследуемых растворов (см. траву зверобоя).

3.4.2.Хроматоспектрофотометрический метод. Название метода обозначает, что в нем сочетаются два подхода — хроматографическая очистка суммы или индивидуальных флавоноидов и последующее спектрофотометрическое определение целевых веществ.

Хроматоспектрофотометрический метод может осуществляться в различных модификациях, но в целом их можно разделить на 2 группы:

1. Хроматографическое отделение флавоноидов от сопутствующих веществ
методом ТСХ или БХ (например, определение рутина в ЛРС). Методики количественного определения рутина в траве гречихи посевной и бутонах софоры японской основаны на хроматоспектрофотометрии, причем в первом случае используется хроматография на бумаге, а во втором — ТСХ. В обоих случаях, используют прием отделения рутина от сопутствующих флавоноидов, а затем измеряют оптическую плотность элюата. В методиках используют ГСО рутина.

2. Хроматографическое отделение флавоноидов от сопутствующих веществ методом колоночной хроматографии (например, леспедеца копеечниковая). В основу разработанного метода количественного определения суммы флавоноидов в надземной части леспедецы положено выделение суммы флавоноидов и определение оптической плотности раствора в этиловом спирте при длинноволновом максимуме поглощения (353 нм) с последующим расчетом процентного содержания по удельному показателю поглощения чистого гомоориетина(лютеолин-6-С-в-0-глюкопиранозид).

3. Фотоэлектроколориметрический метод основан на реакции диазосочетания, а также на основе цветных реакций флавоноидов солями различных металлов(алюминия, циркония, титана, хрома, сурьмы), с лимонно-борным реактивом и на реакции восстановления цинком или магнием в кислой среде.

Методы, имеющее в большей мере теоретическое значение:

1. Полярографический метод. Он основан на способности флавоноидов, напри­мер, флавонолов и флавонов, восстанавливаться на ртутно-капльном электроде.

2. Метод кислотно-основного титрования в неводных растворителях.
Метод основан на способности флавоноидов проявлять слабо выраженных кислотные свойства (из-за наличия в молекуле фенольных гидроксилов, особенно 7-ОН-группы). Метод кислотно-основного титрования осуществляют в неводных растворителях — диметилформамиде, диметилсульфоксиде, ацетоне.

З.Денситометрический метод. Метод основан на цветных реакциях, причем он не требует дополнительных операций по выделению веществ с хроматограмм.