Сущность электрофоретического разделения биологических макромолекул.

Содержание

1. Теоретические предпосылки
  1.1.Сущность электрофоретического разделения биологических макромолекул  
  1.2.Классификация электрофоретических методов
  1.3.Носители применяемые для электрофореза
  1.4.Особенности электрофореза в полиакриламидном геле
  1.5.Способы визуализации результатов
2. Методическая часть лабораторной работы
  2.1. Расходные материалы и оборудование
  2.2. Реактивы
  2.3. Прописи для приготовления требуемых растворов
  2.4. Ход работы
Вопросы для самоконтроля
Список литературы

Теоретические предпосылки.

Методическая часть лабораторной работы.

Таким образом, целью данного практического занятия является ознакомление с методикой анализа белков при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (возможные варианты сокращений, наиболее часто встречающихся в литературе:ДСН‑ПААГ, SDS‑ПААГ, SDS‑PAGE).

Для реализации поставленной цели необходимо:

- приготовить полиакриламидный гель, применимый для разделения белков с соответствующей молекулярной массой;

- приготовить образцы для электрофореза;

- приготовить электродный буферный раствор;

- провести электрофоретическое разделение исследуемых образцов;

- окрасить гель при помощи раствора кумасси ярко-синего

- получить электрофореграмму и проанализировать полученные результаты.

Техника безопасности

Лабораторное занятие проводится при строгом соблюдении правил безопасности при работе в химической лаборатории и эксплуатации электроприборов.

М раствор ЭДТА, рН 8.0

Состав: Na2ЭДТА×2H2O, NaOH, деионизированная вода MilliQ.

Способ приготовления: К 186.1 грамму Na2ЭДТА×2H2Oдобавить 350 мл MilliQ. Подвести рН до 8.0 при помощи 10 Мраствора NaOH (примерно 25 мл). Довести объем раствора до 500 мл деионизированной водой MilliQ.

Буферный раствор TES для приготовления образцов

Состав: 2% SDS, 100 мМтрис-HCl, pH 8.0, 10 мМ ЭДТА, деионизированная вода.

Способ приготовления: Смешать компоненты раствора и довести объем раствора до метки водой MilliQ. Довести рН до 8.0 при помощи соляной кислоты. Отфильтровать и хранить при комнатной температуре.

Лабораторная пропись для получения 50 мл раствора: 10 мл 10%-ного раствора SDS, 5 мл 1М раствора трис, 1 мл 0.5 М раствора ЭДТА, соляная кислота, деионизированная вода.

Буферный раствор 1 М трис-HCl, рН 6.8

Состав: 1М Tрис, соляная кислота, деионизированная вода.

Способ приготовления: Растворить навеску трис в деионизированной воде MilliQ. Довести рН до значения 6.8 при помощи соляной кислоты. Довести объем раствора до метки, отфильтровать и хранить при температуре +4 0С.

Лабораторная пропись для получения 100 мл раствора: 12.13 г трис, соляная кислота, деионизированная вода.

Буферный раствор 1 М трис-HCl, рН8.8

Состав: 1М Tрис, соляная кислота, деионизированная вода.

Способ приготовления: Растворить навеску трис в деионизированной воде MilliQ. Довести рН до значения 8.8 при помощи соляной кислоты. Довести объем раствора до метки, отфильтровать и хранить при температуре +4 0С.

Лабораторная пропись для получения 100 мл раствора: 12.13 г трис, соляная кислота, деионизированная вода.

Окрашивающий раствор для геля:

Состав: 5% CH3COOH, 45% C2H5OH, 0.25% CoomassieR-250, деионизированная вода.

Способ приготовления: Смешать соответствующее количество уксусной кислоты и этилового спирта, довести объем раствора до метки водой MilliQ, добавить сухой краситель сoomassieR-250. Хранить при комнатной температуре. Окрашивающая способность сохраняется на 15 – 20 использований.

Лабораторная пропись для получения 100 мл раствора: 50мл 10%-ной CH3COOH, 45мл 96%-ногоC2H5OH, 0.25 г сoomassieR250.

Вопросы для самоконтроля

1. Какое свойство белковых молекул позволяет им образовывать отдельные зоны на электрофореграмме? От каких условий это свойство зависит и может изменяться?

2. Что такое суммарный заряд белковой молекулы? Почему он изменяется при изменении рН окружающей среды? Что такое pI?

3. Как будет изменяться суммарный заряд белковых молекул при проведении электрофореза в нативных и денатурирующих (SDS) условиях?

4. Подумайте, почему не следует выбирать электродные буферные растворы со значением рН, сильно (более чем на 4 ед) отличающимся от рI разделяемых белков?

5. Напишите структурную формулу полиакриламидного геля. Почему ПААГ считается лучшим носителем жидкой фазы?

6. Для чего при приготовлении геля используют следующие компоненты: персульфат аммония, акриламид, N,N′-метиленбисакриламид, додецилсульфат натрия, трис?

7. Для чего при приготовлении буфера Лэммли используют следующие компоненты: трис, β-меркаптоэтанол, додецилсульфат натрия, глицерин, метиленовый синий?

8. Подумайте, как можно повысить разрешающую способность электрофореза для более эффективного разделения препарата, состоящего из белков со следующими значениями молекулярной массы: 10 кДа, 18 кДа, 30 кДа, 32 кДа, 36 кДа, 48 кДа, 79 кДа, 112 кДа, 220 кДа.

Список литературы

1. «Protein electrophoresis», GE Healthcare Biosciences resources (http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/ru/GELifeSciences/applications/electrophoresis/);

2. U. K. Laemmli. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature, 227, 680-685.

3. H. Schagger, G. von Jagow. 1987. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa// Anal. Biochem., 166, 368-379.

4. Э. Гааль, Г. Медбеши, Л. Верецкеи Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М.: Мир, 1982. – 448 с.

5. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике (в 2-х томах). Минск, 2000. – 463 с.

6. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.: Наука, 1981. – 288 с.

7. Д. Нельсон, М. Кокс. Основы биохимии Ленинджера. Том 1. М.: Бином, 2012. – 696 стр.

8. К. Уилсон, Д. Уолкер. Принципы и методы биохимии и молекулярной биологии. М.: Бином. Лаборатория знаний, 2013. – 848 с.

9. П. Ригетти. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение. М.: Мир.1986. – 399 с.

[1]https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsr/research-and-discovery/products-and-services/capillary-electrophoresis/pa-800-plus-pharmaceutical-analysis-system/index.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/A66527///0/1//0/

[2] J. F. Sambrook and D. W. Russell, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, 2100 pp

[3] Р. Скоупс. Методы очистки белков. М., «Мир».1985. – 358 с.

Содержание

1. Теоретические предпосылки
  1.1.Сущность электрофоретического разделения биологических макромолекул  
  1.2.Классификация электрофоретических методов
  1.3.Носители применяемые для электрофореза
  1.4.Особенности электрофореза в полиакриламидном геле
  1.5.Способы визуализации результатов
2. Методическая часть лабораторной работы
  2.1. Расходные материалы и оборудование
  2.2. Реактивы
  2.3. Прописи для приготовления требуемых растворов
  2.4. Ход работы
Вопросы для самоконтроля
Список литературы

Теоретические предпосылки.

Сущность электрофоретического разделения биологических макромолекул.

В основе метода электрофореза лежит явление миграции заряженных частиц под действием электрического поля. Многие биологические микро- и макромолекулы, такие как пептиды, белки, нуклеиновые кислоты, обладают ионизируемыми группами и при определенном значении рН окружающей среды существуют в растворе в виде положительно заряженных частиц – катионов, либо в виде отрицательно заряженных частиц – анионов. Следовательно, под влиянием внешнего приложенного электрического поля эти заряженные частицы будут мигрировать либо к катоду, либо к аноду, в зависимости от своего результирующего заряда и молекулярной массы.

Метод электрофореза, предложенный еще в начале ХХ века, сейчас широко используют в биологии и медицине для разделения белков в исследовательских и клинических целях. С помощью электрофореза можно разделить на отдельные компоненты белковую смесь, что позволяет установить молекулярную массу белка или его субъединиц, подтвердить чистоту выделенного белка. Таким образом, электрофоретический метод в биохимии – это способ пространственного разделения молекул в плотном пористом геле, имеющих разный заряд и размеры. Результатом проведения электрофореза является электрофореграмма-изображение, полученное после разделения сложной смеси с помощью электрофореза и специфического проявления (окрашивания).

Электрофореграммы белков различных биологических жидкостей человека (сыворотка крови, моча, спинномозговая жидкость и др.) позволяют врачам и медицинским биохимикам получить значительную диагностическую информацию. Результаты электрофоретического разделения ферментов (зимограммы) позволяют изучать изменения активности и изоферментного спектра таких белков под действием внешних и внутренних факторов, как у человека, так и у других организмов (рис. 1).

Обычно белки находятся в растворе в виде заряженных частиц. Заряд на поверхности белков возникает в результате диссоциации группировок, находящихся в боковых радикалах аминокислот (карбоксильных, амино-, имидазольных и др. групп), а также при связывании ионов. Так как степень диссоциации группировок зависит от рН раствора, то величина и знак суммарного заряда белковой молекулы зависят от рН среды, а также от ионной силы (интенсивности электрического поля, создаваемого ионами в растворе).

Сущность электрофоретического разделения биологических макромолекул. - student2.ru

Рис.1. Результаты электрофореза 7 образцов белков в полиакриламидном геле (ПААГ). После разделения белков, гель погружался в раствор красителя – CoomasieR250, который связывается с молекулами белков. Изображение (электрофореграмма) было получено сканированием окрашенного геля.

Для каждого белка существует такое значение рН среды (обозначаемое как рI – изоэлектрическая точка), при котором положительные и отрицательные заряды ионизированных групп будут скомпенсированы. Вследствие этого факта, заряд всей белковой молекулы равен нулю. Таким образом, в буферном растворе со значением рН = рI изучаемого белка, невозможно движение белковой молекулы в приложенном электрическом поле.

Из-за разницы в аминокислотном составе, все белки имеют разные значения рI. При рН ≠ pI молекулы белка приобретают заряд и под действием электрического поля перемещаются к противоположно заряженномым электродам – катоду(‑) или аноду(+). Например, кислые белки, богатые моноаминодикарбоновыми аминокислотами (аспарагиновая кислота, Asp; глютаминовая кислота, Glu), даже в буферном растворе со слабощелочным значением рН (8.0 – 8.5) приобретут значительный суммарный отрицательный заряд, вследствие диссоциации карбоксильных групп на СОО и H+ и будут двигаться к аноду.

Для электрофоретического разделения биологических макромолекул оптимально такое значение рН рабочего буферного раствора, которое обусловливает максимальное различие зарядов разных белков, составляющих исходную смесь, а не их максимальный заряд. Обычно электрофорез проводят в среде (буфере) со значением рН, на 3 — 4 единицы отличающимся от среднего значения рI для белков данного типа. Это позволяет добиться хорошей электрофоретической подвижности и вместе с тем – сохранить ощутимые различия молекул по заряду. Предпочтительно использовать буфер известной и постоянной ионной силы на основе однозарядных ионов. От рабочего буфера также требуется существенная емкость, так как локальная концентрация белка в образующихся при разделении смеси зонах скопления молекул может оказаться значительной. Поэтому используют буферы с концентрацией не менее 0.1 — 0.2 М. При проведении электрофореза электрическое поле создают с помощью источника питания – стабилизированного выпрямителя, способного давать регулируемое напряжение до 100 – 1000 вольт (В), при силе тока в несколько десятков миллиампер (мА).

Электрофорез проводят в однородном электрическом поле, то есть в поле, напряженность E которого во всех точках одинакова. Электрический ток пропускают через проводник – буферный раствор, налитый в канал из изолирующего материала (например, стекла) или пропитывающий какую-либо поддерживающую среду – носитель (например, бумагу или гель). Сопротивление R буферного раствора задается двумя факторами: концентрацией в нем свободных ионов и их электрофоретической подвижностью. Электрофоретической подвижностью (u) данной молекулы называют скорость движения заряженной молекулы (выражаемой в см/ч) в электрическом поле с напряженностью 1 В/см. Именно различия в электрофоретической подвижности белков, содержащихся в анализируемой смеси, делают возможным разделить эти белки в пространстве (в разных зонах электрофореграммы).

Скорость V движения белков к тому или иному электроду снижается из-за их трения в окружающей среде. Сила трения прямо пропорциональна скорости движения белковых молекул. Коэффициент трения белковой молекулы, обозначенный как f, зависит как от размера, формы и степени гидратированности этой молекулы, так и от свойств самой среды. Электрофоретическая подвижность белка зависит:

Ø от самой молекулы: ее размера (молекулярной массы), формы, электрического заряда, степени диссоциации и гидратации,

Ø от концентрации молекул,

Ø от среды: ее вязкости, рН, температуры и ионной силы,

Ø от характеристик используемого электрического поля (для крупных макромолекул применяется электрофорез в пульсирующем электрическом поле).


Наши рекомендации