Цикл ди- и трикарбоновых кислот

В опытах с дрожжами Л. Пастер обнаружил, что в присутствии кис-лорода снижается интенсивность брожения (превращение глюкозы в спирт), но одновременно наблюдается интенсивный рост биомассы дрожжей. В дальнейшем было показано, что усиление биохимической активности клеток дрожжей в аэробных условиях связано с функционированием дыхательного цикла, промежуточными продуктами которого являются органические кислоты. Анализируя полученные данные о влиянии органических кислот на дыхательные процессы, Г.А. Кребс в 1937 г. предложил последовательность реакций окисления лимонной кислоты до СО₂ и Н₂О, которую в дальнейшем стали называть циклом ди- и трикарбоновых кислот или циклом Кребса. Ферменты, катализирующие реакции цикла Кребса, локализованы в матриксе или во внутренней мембране митохондрий.

Непосредственно в реакции цикла Кребса вступает производное пировиноградной кислоты – ацетил-КоА, которое образуется в результате окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты, катализируемого мультиферментным пируватдегидрогеназным комплексом. Ферментный комплекс растворён в матриксе митохондрий и имеет молекулярную массу до 9×10⁶. Он состоит из трёх ферментов: декарбоксилазы, имеющей в качестве кофермента тиаминпирофосфат; дигидролипоилдегидрогеназы, содержащей ФАД; дигидролипоилтрансацетилазы, представляющей собой сердцевинный фрагмент в мультиферментном комплексе, имеющий остатки липоевой кислоты.

На первом этапе пировиноградная кислота взаимодействует с тиаминпирофосфатом декарбоксилазы, в результате чего от пировиноградной кислоты отщепляется СО₂ и происходит образование гидроксиэтильного производного тиаминпирофосфата (ТПФ):

СН₃

|

С=О + ¾® + СО₂

|

СООН

пировиноград- тиазоловое кольцо гидроксиэтильное

ная кислота тиаминпирофосфата производное ТПФ

Затем гидроксиэтильное производное ТПФ взаимодействует с окисленной формой липоевой кислоты в составе фермента дигидролипоилтрансацетилазы. В ходе окислительно-восстановительной реакции гидроксильная группа переносится на остаток липоевой кислоты и превращается в ацетильную группу с образованием макроэргической связи С~S, при этом дисульфидная связь липоевой кислоты восстанавливается:

+ ¾® +

гидроксиэтильное активная группа ТПФ ацетиллипоевая

производное ТПФ липоевой кислоты кислота

Под действием этого же фермента ацетильная группа с макроэргической связью переносится от ацетиллипоевой кислоты на кофермент А:

+ НS – КоА ¾® + СН₃–С~S–КоА

||

О

ацетил-КоА

ацетиллипоевая восстановленная

кислота форма липоевой

кислоты

В качестве продуктов данной стадии превращения пировиноградной кислоты образуются регенерированный тиаминпирофосфат, восстановленная форма липоевой кислоты и ацетил-КоА.

Восстановленная форма липоевой кислоты подвергается окислению под действием фермента дигидролипоилдегидрогеназы, который отщепляет электроны и протоны от восстановленной липоевой кислоты и передает их на окисленный НАД, в результате чего регенерируется окисленная форма липоевой кислоты и синтезируются восстановленные динуклеотиды НАД×Н:

+ ФАД ¾¾® + ФАД×Н₂

фермент–ФАД×Н₂ + НАД⁺ ¾¾® фермент–ФАД + НАД×Н⁺ + Н⁺

Таким образом, конечными продуктами окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты являются ацетил-КоА, восстановленные динуклеотиды НАД×Н и СО₂. НАД×Н включается в различные восстановительные реакции, катализируемые дегидрогеназами, или, как мы увидим далее, становится донором электронов и протонов для системы окислительного фосфорилирования, локализованной в мембранах митохондрий. Ацетил-КоА, как и пировиноградная, щавелевоуксусная и a-кетоглутаровая кислоты – важный промежуточный продукт обмена веществ организмов. Он используется для синтеза жирных кислот, углеводов и многих аминокислот и также образуется при их распаде.

Синтез ацетил-КоА в ходе окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты регулируется концентрациями АТФ и АДФ, а также НАД×Н и НАД⁺. Высокая концентрация АТФ аллостерически ингибирует пируватдегидрогеназный комплекс. При высокой концентрации НАД×Н также наблюдается ингибирование данного ферментного комплекса вследствие пониженной концентрации НАД⁺, необходимого для ренегенерации кофермента ФАД×Н₂ в окисленную форму ФАД.

СН–СООН СН2–СООН (1) || + СН3–С~S-КоА + Н2О ¾® | С(ОН)–СООН || С(ОН)–СООН + НS–КоА енольная форма О | щавелевоуксус- СН2–СООН ной кслоты лимонная кислота

В реакциях аэробного дыхания образовавшийся при окислительном декарбоксилировании пировиноградной кислоты ацетил-КоА включается в реакции цикла Кребса. Вначале происходит конденсация ацетил-КоА с енольной формой щавелевоуксусной кислоты, в ходе которой ацетильная группировка кофермента А соединяется с углеродной цепью щавелевоуксусной кислоты, в результате чего синтезируется лимонная кислота. Эту реакцию катализирует фермент цитратсинтаза (4.1.3.7):

Фермент цитратсинтазу аллостерически ингибирует повышенная концентрация АТФ. Поэтому при высокой обеспеченности клетки энергией, когда повышается концентрация АТФ, вследствие ингибирования цитратсинтазы меньше ацетил-КоА будет включаться в реакции цикла Кребса и больше использоваться на биосинтетические процессы.

В ходе дальнейших превращений лимонная кислота превращается в цис-аконитовую кислоту в результате отщепления молекулы воды под действием фермента аконитатгидратазы (4.2.1.3), локализованного во внутренней мембране митохондрий:

	СН2–СООН СН2–СООН (2) | | С(ОН)–СООН ¾® С–СООН + Н2О | || СН2–СООН СН–СООН лимонная кислота цис-аконитовая кислота

В последующей реакции цис-аконитовая кислота под действием того же фермента присоединяет молекулу воды, превращаясь в изолимонную кислоту:

	СН2–СООН СН2–СООН (3) | | С–СООН + Н2О ¾¾® СН–СООН || | СН–СООН СН(ОН)–СООН цис-аконитовая изолимонная кислота кислота

Изолимонная кислота окисляется в щавелевоянтарную кислоту под действием НАД- или НАДФ-специфичного фермента изоцитратдегидрогеназы (1.1.1.41). Образовавшаяся щавелевоянтарная кислота самопроизвольно декарбоксилируется, превращаясь в a-кетоглутаровую кислоту:

	СН2–СООН СН2–СООН СН2–СООН (4) | НАД(Ф)+ | | СН–СООН ¾¾¾® СН–СООН ¾¾® СН2 + СО2 + НАД(Ф)×Н + Н+ | | | СН(ОН)–СООН СО–СООН СО–СООН изолимонная кислота щавелевоянтар- a-кетоглута- ная кислота ровая кислота

Фермент изоцитратдегидрогеназа ингибируется высокой концентрацией НАД×Н и аллостерически активируется лимонной кислотой. Это – опережающая активация, когда определённый метаболит (в данном случае лимонная кислота) активирует ферменты, катализирующие его последующие превращения.

Продукт реакции 4 a-кетоглутаровая кислота подобно пировиноградной кислоте подвергается окислительному декарбоксилированию под действием a-кетоглутаратдегидрогеназного ферментного комплекса, который имеет такой же состав и строение, как и пируватдегидрогеназный комплекс. В результате декарбоксилирования a-кетоглутаровой кислоты образуется ацильная группировка янтарной кислоты, которая переносится на кофермент А с образованием макроэргического соединения сукцинил~S–КоА. Суммарное уравнение процесса окислительного декарбоксилирования a-кетоглутаровой кислоты можно представить в следующем виде:

СН2–СООН СН2–СООН (5) | | СН2 + НS–КоА + НАД+ ¾® СН2–С~S–КоА + СО2+ НАД×Н + Н+ | || СО–СООН О a-кетоглутаровая сукцинил-КоА кислота

a-Кетоглутаратдегидрогеназный комплекс ингибируется высокой концентрацией НАД×Н и аллостерически активируется АДФ и АМФ, тогда как при высокой концентрации АТФ действие ферментного комплекса подавляется.

В ходе дальнейших превращений энергия макроэргической связи сукцинил~S–КоА используется для синтеза АТФ, который осуществляется в процессе субстратного фосфорилирования и катализируется ферментом сукцинил-КоА-синтетазой (6.2.1.5). Вначале фермент образует макроэргическое промежуточное соединение с группировкой кофермента А, а ацильный радикал янтарной кислоты превращается в свободную янтарную кислоту. Коферментная группировка присоединяется к атому азота амидазольного кольца гистидина в каталитическом центре фермента. Затем группировка кофермента А в каталитическом центре фермента замещается на остаток фосфата с образованием макроэргического фосфофермента (фермент~ Р), от которого остаток фосфорной кислоты с макроэргической связью переходит на АДФ, осуществляя таким образом синтез АТФ. Суммарное уравнение процесса фосфоролитического расщепления сукцинил– КоА и сопряжённого с ним синтеза АТФ можно записать в виде следующей схемы:

	СН2-СООН СН2-СООН (6) | + Н3РО4 + АДФ ¾¾® | + НS-КоА + АТФ СН2-С~S-КоА СН2-СООН || янтарная кислота О сукцинил-КоА

СН2-СООН HOOC H (7) | \ / CH2-COOH + ФАД ¾¾® C=C + ФАД×Н2 янтарная кислота / \ H COOH фумаровая кислота

Как показано в представленных выше реакциях, у растений в результате фосфоролитического расщепления сукцинил-КоА осуществляется синтез АТФ, тогда как в клетках животного организма в аналогичном процессе происходит синтез ГТФ с участием ГДФ. Образовавшаяся в реакции 6 янтарная кислота окисляется с участием фермента сукцинатдегидрогеназы, локализованного во внутренней мембране митахондрий. Сукцинатдегидрогеназа имеет в качестве кофермента динуклеотиды ФАД. В ходе этой реакции янтарная кислота превращается в фумаровую:

Сукцинатдегидрогеназа аллостерически ингибируется щавелевоуксусной кислотой и активируется АТФ и восстановленным убихиноном (КоQ×Н₂).

НООС Н (8) \ / С = С + Н2О ¾® НООС-СН2-СН(ОН)-СООН / \ яблочная кислота Н СООН фумаровая кислота

В следующей реакции к фумаровой кислоте присоединяется молекула воды под действием фермента фумаратгидратазы (4.2.1.2) и образуется яблочная кислота:

В дальнейшем яблочная кислота окисляется в щавелевоуксусную кислоту с участием НАД-специфичного фермента малатдегидрогеназы (1.1.1.37):

	СН2-СООН СН2-СООН (9) | + НАД+ ¾® | + НАД×Н + Н+ СН(ОН)-СООН СО-СООН яблочная кислота щавелевоук- сусная кислота

Малатдегидрогеназа ингибируется повышенной концентрацией щавелевоуксусной кислоты и НАД×Н.

СН2-СООН СН-СООН (10) | D || СО-СООН С(ОН)-СООН кетоформа енольная форма щавелевоуксус- щавелевоуксусной ной кислоты кислоты

Кетоформа щавелевоуксусной кислоты самопроизвольно превращается в свою енольную форму:

После этого енольная форма щавелевоуксусной кислоты может взаимодействовать с новой молекулой ацетилкофермента А и рассмотренный нами цикл реакций будет повторяться снова.

Если исключить промежуточные продукты, образующиеся в реакциях окислительного дикарбоксилирования пировиноградной кислоты и цикла Кребса, и записать только вещества, входящие и выходящие из этого цикла при условии полного прохождения всех указанных выше реакций, то можно получить следующее суммарное уравнение:

СН₃-С-СООН + 2Н₂О + 3НАД⁺ + НАД(Ф)⁺ + ФАД + Н₃РО₄ + АДФ ¾®

||

О

® 3СО₂ + 3НАД×Н + НАД(Ф)×Н + ФАД×Н₂ + 4Н⁺ + АТФ

Исходя из этого уравнения видно, что пировиноградная кислота в ходе происходящих превращений окисляется с образованием трёх молекул СО₂ и пяти молекул восстановленных динуклеотидов НАД×Н, НАДФ×Н и ФАД×Н₂. Источником кислорода для реакций окисления служат молекулы воды, две из них показаны в левой части уравнения и одна высвобождается при взаимодействии Н₃РО₄ и АДФ. Молекулы воды также являются донорами электронов и протонов для синтеза восстановленных динуклеотидов.

Как видим, прямого участия молекул кислорода в реакциях цикла Кребса нет, хотя указанные реакции активируются кислородом. Непосредственное участие кислорода в реакциях дыхания происходит на стадии окисления восстановленных динуклеотидов, образующихся при окислительном декарбоксилировании пировиноградной кислоты и в реакциях цикла Кребса, с участием ферментных комплексов, локализованных во внутренних мембранах митохондрий. И эти процессы будут рассмотрены далее.

Кроме восстановленных динуклеотидов, в цикле Кребса происходит также синтез АТФ из неорганического фосфата и АДФ путём реализации механизма субстратного фосфорилирования. Как мы увидим далее, при окислении восстановленных динуклеотидов также осуществляется синтез молекул АТФ, являющихся универсальными для многих организмов биоэнергетическими продуктами, способными осуществлять транспорт энергии в организме и участвовать в реакциях сопряжённого синтеза веществ.

В реакциях окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты и цикла Кребса образуются не только важные биоэнергетические продукты, но и промежуточные метаболиты, с участием которых осуществляется связь обмена углеводов с обменом липидов, аминокислот, белков и других органических веществ в организме. Как было указано ранее, к таким веществам относится ацетил-КоА.

Важными промежуточными продуктами также являются щавелевоуксусная и a-кетоглутаровая кислоты. В результате их аминирования синтезируются аминокислоты аспарагиновая и глутаминовая, которые занимают центральное место в обмене азотистых веществ и из этих аминокислот при их распаде образуются указанные выше кетокислоты. В результате оказывается возможным окисление аминокислот путём включения образующихся из них кетокислот в цикл Кребса.

Наряду с кетокислотами в цикле Кребса образуются лимонная и изолимонная, цис-аконитовая, янтарная, фумаровая, яблочная кислоты, через которые осуществляется связь цикла Кребса с обменом органических кислот. Благодаря тому, что при распаде липидов, изопреновых производных, ряда аминокислот и других азотистых веществ образуется ацетил-КоА, они могут использоваться в организмах как субстраты дыхания, так как получаемый в процессе их распада ацетил-КоА может включаться в реакции цикла Кребса и подвергаться полному окислению.

Если в ходе окисления ацетил-КоА в реакциях цикла Кребса промежуточные продукты не выводятся из цикла для синтеза других веществ, то происходит полная регенерация первого продукта, с которым реагирует ацетил-КоА, - щавелевоуксусной кислоты. Однако в реальных физиологических условиях из цикла Кребса постоянно потребляются на различные биосинтетические процессы те или иные промежуточные метаболиты, поэтому циклический ход регенерации щавелевоуксусной кислоты в этих случаях не завершается и для обеспечения хода реакций цикла необходимо постоянно поддерживать необходимую концентрацию щавелевоуксусной кислоты в матриксе митахондрий путём её дополнительного синтеза.

У растений и бактерий первичный синтез щавелевоуксусной кислоты осуществляется под действием фермента фосфопируваткарбоксилазы из СО₂ и фосфоенолпировиноградной кислоты:

	СН2 СН2-СООН || | + Н3РО4 СО~ Р + СО2 + Н2О ¾® СО-СООН | щавелевоуксусная СООН кислота фосфоенол- пировиноградная кислота

В животных клетках аналогичную функцию выполняет фермент пируваткарбоксилаза, катализирующий реакцию карбоксилирования пировиноградной кислоты:

	СН3 СН2-СООН | | С=О + СО2 + Н2О + АТФ ¾® СО-СООН + АДФ + Н3РО4 | щавелевоуксусная СООН кислота пировиноград- ная кислота

Таким образом, цикл Кребса является связующим звеном в обмене различных групп органических веществ и конечным этапом их окисления. В ходе этих реакций высвобождается значительное количество энергии окисляющихся субстратов и связывается главным образом в виде восстановленных форм динуклеотидов НАД×Н и ФАД×Н₂, энергия которых используется для синтеза АТФ.