Анализ двухкомпонентных смесей

(на примере аминокислот)

В основе количественного определения состава смесей спектрофотометрическими методами лежит правило аддитивности: поглощение света раствором любой смеси является суммой поглощений отдельных компонентов.

При условии выполнения закона Ламберта-Бугера-Бера

D = ε · c · l (1)

где D – оптическая плотность

ε - коэффициент экстинциии

c - концентрация соединения в растворе (моль/л)

l - толщина слоя (кюветы) раствора в сантиметрах

и известных коэффициентах экстинции для каждого вещества в отдельности измеряемая оптическая плотность смеси при любой длине волны может быть найдена по уравнению:

D = (ε₁ · c₁ + ε₂ · c₂ + ε₃ · c₃ + …) · l (2)

Если в смеси содержится n компонентов, то измерения оптической плотности должны быть проведены при n различных длинах волн и, соответственно, должны быть решены n уравнений. Этот метод особенно широко применяется для анализа двухкомпонентных систем. Две длины волны выбираются таким образом, чтобы при одной из них интенсивности поглощения соединений сильно различались, а при другой оба вещества имели бы достаточно сильное поглощение. Существенно также, чтобы выбранные длины волн находились на участках спектральных кривых с малым наклоном (обычно в точках, близких к максимумам и минимумам полос), поскольку, когда небольшие изменения длины волны сопровождаются большими изменениями оптической плотности, точность определения значительно снижается.

В данной работе предлагается проанализировать смесь двух аминокислот, входящих в состав белков – триптофана (α – амино - β-индолилпропионовая кислота) и тирозина ( α - амино-β-(пара-гидроксифенил) пропионовая кислота).

Эти аминокислоты имеют избирательное поглощение в области 220 – 350 нм.

Тирозин λ при 294 нм (ε²⁹⁴ = 2550 ) в 0.1 М растворе NaOH

Триптофан λ при 281 нм (ε²⁸¹ = 5000 ) в 0.1 М растворе NaOH

Кривые поглощения этих аминокислот пересекаются в точках 294 и 257 нм (изобестические точки), в в которых ε_тир = ε_три. Тогда из уравнения (2) можно легко определить сумму молярных концентраций:

с = с₁ + с₂ = D²⁹⁴ / ε²⁹⁴ = D²⁵⁷ / ε²⁵⁷ ( 3 )

Измерив интенсивность еще при одной длине волны λ, находят содержание каждой аминокислоты в смеси:

C₁ = (D^λ – ε₂^λ · c ) / (ε₁^λ – ε₂^λ ) ( 4 )

Индекс 1 относится к тирозину, 2 – к триптофану.

Порядок выполнения работы

1. Приготовьте растворы аминокислот в 0.1 М растворе NaOH следующих концентраций: триптофан – 2·10^{-4 М, тирозин – 3·10-4 М.}

2. Запишите на спектрофотометре индивидуальные спектры тирозина и триптофана в области 220 – 350 нм.

3. Рассчитайте с помощью формулы (1) коэффициент экстинции тирозина при 281 нм.

4. Смешайте исходные растворы триптофана и тирозина в отношении 3: 2, соответственно и запишите на спектрофотометре спектр их смеси.

5. Рассчитайте суммарную концентрацию аминокислот в их смеси по уравнению (3), используя значение оптической плотности раствора аминокислот при 294 нм.

6. Рассчитайте с помощью уравнения (4) концентрацию каждой аминокислоты, используя значение оптической плотности смеси при 281 нм.

7. Зная точное значение концентраций тирозина и триптофана, определите ошибку измерения.

Лабораторная работа № 3:

ГЕЛЬ - ХРОМАТОГРАФИЯ

Гель-хроматография (гель-фильтрация) – фракционирование смеси компонентов по размерам молекул при прохождении их через гели с определенной величиной пор, такие как сефадексы, биогели, агарозные гели и т.д.

Принцип метода заключается в том, что при пропускании через колонку с гелем, имеющим сетчатую структуру, раствора, содержащего несколько веществ, наибольшей скоростью продвижения обладают компоненты, размеры молекул которых больше пор геля. Такие компоненты не проникают в гранулы неподвижной фазы и выходят из колонки первыми. Более мелкие молекулы, способные проникать внутрь пор геля, продвигаются по колонке медленнее и вымываются позднее.

Разделение веществ может быть описано классическим уравнением хроматографии

V_R = V₀ + KV_S

где V_R – объем элюирования растворенного вещества

V₀ – мертвый ( V_m ) или свободный объем колонки ( объем растворителя между частицами геля, объем подвижной фазы)

V_S – объем растворителя, заключеннного в порах геля

К – коэффициент распределения растворенного вещества, равный отношению концентраций вещества в неподвижной и подвижной фазах.

Можно рассматривать KV_S как объем растворителя в неподвижной фазе доступный для растворенного вещества.

Так как подвижная и неподвижная фазы имеют одинаковый состав, то К вещества, для которого обе фазы одинаково доступны, равен единице. Эта ситуация реализуется для молекул с самыми малыми размерами, которые проникают во все поры и поэтому движутся через колонку наиболее медленно. Их удерживаемый объем равен полному объему растворителя (V_t) в заполненной гелем части колонки

V_R = V₀ + KV_S = V₀ + 1×V_S = V_t

Все молекулы, размеры которых больше размера пор геля, не могут попасть в них ( полная эксклюзия) и проходят по каналам между частицами. Они элюируются из колонки одним и тем же удерживаемым объемом, равным объему неподвижной фазы V₀. Коэффициент распределения для этих молекул равен нулю.

Полный объем растворителя в колонке V_t представляет собой сумму объемов подвижной и неподвижной жидких фаз

V_t = V_R = V₀ + V_S